【5.8.2】蛋白质熔点表征(Tm)

蛋白质由多肽链组成,在细胞内由 20 种不同的氨基酸类型合成。与人造和无规卷曲生物聚合物相比,蛋白质的多肽链在自然状态下折叠成独特的 3 维结构。这些结构通过静电和疏水相互作用的组合以及结构内氨基酸侧链之间的多个氢键的形成而稳定。

一、蛋白质变性

蛋白质被进化为在生物系统中执行特定功能,例如催化反应和运输小分子或离子。这种功能性要求蛋白质结构具有很大程度的灵活性。因此,稳定蛋白质结构的相互作用刚好足以在狭窄的环境条件范围内维持结构。如果溶液条件在此范围之外,例如通过改变 pH 值或温度,熵驱动的变性或解折叠会迅速发生。当发生变性时,蛋白质的小尺寸增加到与相同分子量的无规卷曲聚合物一致的值。在没有离液(聚集禁止)剂的情况下,聚合物间的疏水相互作用会迅速导致变性多肽链的非特异性聚集。图 1 显示了变性过程以及随后的尺寸变化。

Figure 1. Schematic detailing the protein denaturation process and the subsequent change in hydrodynamic size indicated by the diameter of the solid circle.

二、用于表征蛋白质的动态光散射 Dynamic Light Scattering for Characterization of Proteins

动态光散射 (DLS,Dynamic light scattering ) 长期以来一直被用作蛋白质表征工具。在 DLS 中,测量粒子的布朗运动,并使用 Stokes-Einstein 方程计算流体动力学尺寸。DLS 的灵敏度足以区分不同的寡聚和四元蛋白质状态,非常适合监测蛋白质结构对变性条件的稳定性。

三、蛋白质熔点 The Protein Melting Point

蛋白质熔点 (TM,melting point) 定义为蛋白质变性的温度。使用 DLS 技术可以轻松识别伴随蛋白质变性的大小变化。例如,考虑图 2,它显示了使用Zetasizer Nano ZS测量的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中卵清蛋白的温度依赖 Z 平均直径和散射强度。在低于 71°C 的温度下,尺寸和散射强度恒定,表明三级结构稳定。在 71°C 及更高温度下,尺寸和散射强度均随温度呈指数增长,表明存在变性聚集体。

Figure 2. Melting point trace and hysteresis for Ovalbumin in PBS.

四、响蛋白质熔点的因素

由于与特定蛋白质类型相关的氨基酸的独特一级序列,熔点可能会有显着差异。溶液条件,例如 pH 值和盐浓度,以及翻译后修饰,例如糖基化,也会对蛋白质结构的稳定性和解链温度产生显着影响。因此,熔点测量是目标蛋白质总体表征的重要步骤,特别是如果蛋白质注定要整合到药物产品或制剂中。图 3 显示了 PBS 中一系列蛋白质的熔点曲线。使用 Zetasizer Nano ZS 收集自动测量值,在每个测量温度下使用 1°C 增量温度斜坡和 3 分钟的平衡时间。

五、测量的仪器

  • The Malvern Panalytical Zetasizer Nano System

参考资料

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