【5.2.3.7】纯化需要注意的

一、蛋白质洗脱方法

固定相上结合的蛋白质要用可破坏结合作用力的溶剂条件进行洗脱。这些流动相的条件要根据层析类型和目标蛋白质的性质来选择。蛋白质洗脱方法通常包括以下三种:批次洗脱,阶梯式洗脱和线性梯度洗脱。如何选择最好的方法要依靠采用的层析方式和所需的分离效果来决定。

  1. 批次洗脱 - 一步即将所有结合蛋白质一次性洗脱。基于特异性相互作用 (如亲层析)的层析方法最好采用这种方式。批次洗脱法没有任何分离效果,但它可以很好地快速去除杂质。它需要事先了解取代目标蛋白所需的缓冲液条件。

  2. 阶梯式洗脱 - 连续进行多步批次洗脱,并每次逐渐增强洗脱条件。在阶梯式洗脱中,收集的组分数取决于连续批次洗脱的次数。阶梯式洗脱比批次洗脱的分离效果要好,但比线性梯度洗脱的效果要差。

  3. 线性梯度洗脱 - 当流动相以线性梯度洗脱时可收集多种连续流出的组分。对于离子交换层析和疏水作用层析,线性梯度洗脱可以获得最好的分离效果,同时,它还可以收集到大量的连续组分。

由于体积排阻层析中蛋白质和固定相之间不存在相互作用,因此不需要采用任何一种上述洗脱方法。蛋白质上样后,无需改变洗脱缓冲液的条件,即可连续不断地收集各分离组分至所有蛋白质全部被洗脱为止理想的情况是这根层析柱所采用的洗脱缓冲液同样可用于后续的层析柱,由此可省去两步之间必须的缓冲液置换或者透析操作。

二、其它色谱方法

羟基磷灰石(羟基磷酸钙)是最初在20世纪50年代中期描述的蛋白质纯化技术。球形羟基磷灰石的商业可得性使羟基磷灰石柱色谱法成为可及的技术。蛋白质与羟基磷灰石柱相互作用的机制是复杂的。蛋白质最常用磷酸盐梯度洗脱。羟基磷灰石与其他色谱技术具有不同的选择性,因此可以对有难度的蛋白纯化或作为最终“抛光”步骤提供有效补充。羟磷灰石层析已经成功地用于治疗级抗体的纯化。

色谱聚焦是一种基于其pI分离蛋白质的柱层析法。蛋白质结合到专门的离子交换介质上并用pH梯度洗脱。色谱聚焦的选择性不同于其他技术的选择性,因此可用作最终的“抛光”步骤。

三、组分纯度分析

每一次柱层析分离完成后,收集的组分必须进行分析以检测其所含的目标蛋白及各组分的相对纯度。每一步之后都需要进行该类分析以确定哪些组分可以被合并用于下一步。为检测纯度,必须有一种方法能检测出某种特定蛋白质相对所有蛋白质的含量。下列即为一些常用于纯度分析的方法:

1、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) - 一种基于蛋白质尺寸不同来进行分离的变性凝胶。市售染色剂可使样品中所有蛋白质显色可见,可据此对蛋白质进行纯度分析(图10)。SDS-PAGE不能对组分进行大规模的分析,并且需要耗费数小时。但由于易操作、经济且适用于所有蛋白,因此它仍然是一种最常用采用的方法。

图 10. 蛋白质纯化工艺中收集的蛋白质样品的SDS-PAGE检测结果。

2、光谱分析 - 一种分析蛋白质光学性质的方法。这种用于蛋白质纯度分析的方法只适用于如细胞色素P450等具有独特光学特征的蛋白质。这一类蛋白质在某特定波长(420 nm附近 [40] )有吸收而其他蛋白质没有,因此比较它在420nm和280nm处 (该波长处所有蛋白质均有吸收) 的吸收,即可获得该蛋白质的纯度信息。这个方法快速且可大规模操作,但仅使用于部分蛋白质。

3、蛋白质测活 - 一种目标蛋白的酶活实验。这种测定蛋白质纯度的方法通常与其他蛋白质浓度测定方法相结合以计算其相对整体蛋白质浓度的活性。活性测试只适用于活性可以被高通量方法如酶解测活的蛋白质。对某些蛋白质而言,活性测试提供了一种快速可靠的蛋白质检测方法。酶的测活是非常有用的,因为这样在下一步应用前即可先将失活的蛋白质排除出去。

四、纯化后蛋白保存

当蛋白质纯度已满足实验研究的要求时,即可将其以合适的方式保存起来。最终保存用缓冲液的选择和纯化过程中选择所用的缓冲液一样重要,同样依赖于蛋白质的稳定性和纯化蛋白质后续应用所需条件来选择。通常,因为在SEC层析过程中可以完成缓冲液的有效置换,因此它通常被安排为整个纯化工艺的最后一步。纯化的组分可以立即合并保存,或者最后合并的组分也可以透析为所选的缓冲液后再保存。

由于蛋白质的保存条件取决于目标蛋白本身,应将其优化至能长期保持蛋白质结构和功能稳定性的条件。在储存条件下,保存缓冲液中通常会加入一些添加剂用于延长纯化蛋白的保存期。由于每种蛋白质的表现各不相同,因此需要通过多次实验来寻找最合适的保存条件。

参考

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