【8.3.3.1】Clean-PIE

环状mRNA因为其无需加帽加尾的闭环结构,体内外更稳定,表达时间更长,制备工艺更简单,成本更优,有望成为线性mRNA的替代者,开启mRNA 2.0时代。

2022年6月21日,苏州科锐迈德生物医药科技有限公司(以下简称科锐迈德或CureMed)在预印版bioRxiv发表题为:Clean-PIE: a novel strategy for efficiently constructing precise circRNA with thoroughly minimized immunogenicity to direct potent and durable protein expression的研究论文

新的Clean-PIE成环策略巧妙地通过筛选蛋白编码区或者IRES区找到了最优的成环位点,通过蛋白编码区或者IRES区连接成环实现了无外源序列引入,且具有环化效率高(>90%)、序列精准的特点,同时通过该方法得到的环状RNA免疫原性比ORNA所得到的环状RNA更低,且表达效率高,表达时长持久。该研究还建立了一套剪接位点自动化预测筛选系统,针对不同序列进行高效计算。另外,值得一提的是,该研究建立了高效IRES元件筛选系统,通过筛选600余条IRES序列,得到20多条新的优于CVB3表达的IRES序列。

环状RNA(circular RNA, circRNA真核生物体内是由反向剪接(back-splicing)过程产生的共价闭合环状RNA。1976年,Sanger首次在类病毒中发现了单链共价闭合环状的RNA分子,但是很长时间以来一直被认为是细胞内mRNA错误剪接的产物,并没有实际的功能。90年代末期到20世纪初,多项研究发现多种基因可以产生circRNAs。进入2010年以后,随着RNA-seq技术的发展,引爆了circRNA 研究。2017年,几个课题组相继报道了circRNAs能够在真核生物体内以帽子独立(Cap-independent)的方式翻译。

在circRNA最终走向临床应用过程中,多个关键难题摆在我们面前亟待突破:

  1. 如何实现circRNA高效精准环化?

  2. 如何避免外源序列引入带来的免疫原性?

  3. 如何实现circRNA高效组织特异性的表达蛋白?

  4. 如何获得高纯度circRNA,避免precursor和nicked RNA等杂质干扰?

  5. 如何实现稳定量产工艺放大?

目前体外RNA环化策略主要3种:化学方法,连接酶方法(T4 RNA ligases),核酶方法(groupⅠ、groupⅡself-splicing introns)。连接酶和核酶方法最为常用

  • Method I:T4 RNA ligase连接
  • Method II:group I、group II intron 自剪接
  • Method III:Clean-PIE 系统,group I intron自剪接

一、I型内含子自剪接

MIT Daniel. G. Anderson2研究组通过工程化改造鱼腥藻(Anabaena)I型内含子实现了体外长编码RNA的环化,在镁离子和GTP存在下,发生两次酯交换反应,形成环状RNA。通过优化经典的鱼腥藻PIE ,通过增加同源臂(homology arm)、间隔序列(spacer),解决长编码RNA序列成环的难题,并且能够得到较好的成环效率。另外一方面,通过HPLC纯化策略以及IRES序列筛选增强了circRNA在细胞内蛋白表达的稳定性和效率。这种成环策略由于增加了间隔序列且外显子序列较长,所以需要在最终的环状RNA产物中额外引入186nt碱基序列。

二、II型内含子自剪接

II型内含子(group II intron)存在于原生生物、真菌以及细菌基因组中。在体内II型内含子可通过两步连续的转酯反应从前体RNA中自剪接,并连接两侧外显子,许多II型内含子的剪接反应是由蛋白质辅助完成的。同时II型内含子也被证明可以在体外通过自我催化发生剪切反应。

如下图所示,采用破伤风杆菌group II intron自催化剪接反应,引入IBS1和IBS3短的外源序列,或者通过控制内含子插入过程中与外显子配对的EBS序列可改变RNA靶点,这种经过修饰的II类内含子称为“targetron”。通过这种方式设计的破伤风杆菌II型内含子和酵母菌II型内含子剪接系统可以做到无外源序列残留的circRNA人工体外制备5。如下图所示,成环效率有待提高,并且成环条带中含有的nicked RNA 需要进一步鉴定。

三、T4 RNA ligase

T4 DNA/RNA ligase 体外连接成环的方法可以避免如上外源序列引入导致的免疫原性。但是,T4连接酶相对低效的连接效率和需要借助DNA夹板序列辅助的成环方法,使其很难实现工业化制备;该方法也发展了借助内源性的夹板链实现RNA的环化3,6。如下图所示:

其二,T7 RNA 聚合酶在转录过程中会在3’末端随机引入1-3个额外的guanine(G)1,使得T4 RNA ligase的方法应用于IVT体外转录的RNA成环时获得的序列不准确;

其三,T4 RNA 连接酶催化单链 RNA分子间和分子内5'-磷酸基团和 3'-羟基末端形成磷酸二酯键,体外转录后需要RNA链5’末端预先去磷酸化,操作繁琐且成环效率不高。如下图所示:

四、Clean-PIE group I intron自剪接系统

ORNA group I intron Ana PIE成环策略引入186nt外源序列带来的免疫原性,破伤风杆菌和酵母菌group II intron体外较低的剪接效率,T4 RNA ligase成环方法序列不准确性和操作繁琐都是制约环状RNA应用于临床的壁垒。

2022年6月21日,CureMed发表在预公开平台bioRvix上的文章,公开了一种新型的Clean-PIE的环状RNA成环策略。该研究巧妙地通过筛选蛋白编码区或者IRES区找到了最优的成环位点,通过蛋白编码区或者IRES区连接成环实现了无外源序列引入的RNA成环连接

同时,该研究还建立了一套剪接位点自动化筛选优化系统。通过针对不同序列进行高效计算优选出最佳的成环位点。通过对大肠杆菌或者人类基因组内所有大于500bp的基因进行评测,发现通过优化系统可以在99.9%的H. sapiens 基因和100%的E.coli的基因中筛选的到13分以上的成环位点(即与最优成环序列只相差一个碱基)。这证明了该成环策略具有普适性。

同时该研究优化了环状RNA的序列构成,通过添加polyAC序列提高了环状RNA的表达。

Clean-PIE系统的优点在于无外源序列引入,成环序列精准。该文章研究数据表明,相较于ORNA成环策略,转染Clean-PIE环状RNA的细胞内IFN-β、RIG-1、IL-6、MDA-5表达更低,体外细胞水平蛋白表达也明显优于ORNA。

另外,为了实现circRNA高效组织特异性的表达蛋白,该研究建立了高效的IRES筛选平台,已经筛选了600余个IRES序列,其中20余个IRES元件表达量显著高于CVB3,并初步掌握了IRES组织特异性表达的数据。

参考资料

个人公众号,比较懒,很少更新,可以在上面提问题,如果回复不及时,可发邮件给我: tiehan@sina.cn