【6.7.1】CRISPR脱靶预测经验

很难清楚地预测脱靶位点的实际切割,因为它可能高度依赖序列和基因座可及性。

  • https://zlab.bio/guide-design-resources 可以预测目标基因座的位置,但要检查的地方很多,因为在3x10^9 bp基因组中,与20 bp序列的近亲很有可能。
  • 在某些情况下,单个错配会导致sgRNA诱变效率下降,而在其他情况下,可以容忍3至4个。 (这是对要测序的DNA进行测序的最佳理由,以设计指南,而不是依赖数据库的gDNA序列来避免对SNP不匹配的靶的效率损失)。

但首先,对脱靶的关注有所改变,这取决于您要在其上应用CRISPR / Cas9工具的模型。如果在细胞上,脱靶确实将是一个重要的问题,如果在鼠上,尽管backcross 时间很长(并且只要可能的脱靶不会影响目标受精卵开发,则可以通过backcross 摆脱脱靶突变。

但是,有一些经验法则:

  • 接近PAM的错配(5’-3’的11-20位核苷酸)比可耐受得多的指导序列的nt1-10的错配更能降低Cas9 DNA的切割活性。我想说的与PCR引物在3’末端退火失配类似。
  • 双切口使目标切割的断裂下降到NGS的检测水平以下,并且当不引导向导驱动wt Cas9时,可能由于DSB可能改变了单个靶位,这是因为单个向导携带单个切口酶的诱变性可能要低得多而不是NHEJ,通过碱基切除修复技术进行了高保真修复。

请参见Zhang和Church实验室的论文,Cong 2013,Ran 2013,Mali 2013。

顺便说一句,根据一些DNA修复专家的说法,DSB的NHEJ修复不像在CRISPR / Cas9诱变中那样具有诱变性(并且如在VDJ重组中得到适当控制时具有很高的特异性)。人们认为,存在于DNA上或在DSB后停留的空间较大的Cas9(〜160 kDa)可能会加剧CRISPR / Cas9方法中的诱变NHEJ修复。因此,对于在某些情况下可能在SSB修复过程中促进诱变事件的切口酶也是如此。综上所述,请记住,低于NGS的检测水平并不意味着零。

  • 使用重组Cas9和体外合成的sgRNA进行转染或核转染比在用PX系列质粒转染时在细胞中产生的Cas9少得多。有关其Alt-R系统的信息,请参阅IDT文档。人们认为,使用更少的Cas9可以在更短的时间内降低偏离目标的风险。

最后,避免出现脱靶问题的最佳方法是应用良好的实验设计和控制规则,与siRNA shRNA时代相比,CRISPR新颖性没有改变。使用多个指南,例如至少两个指南,它们的序列明显不同,因此与靶位点不同,如果要生成克隆,请在每个指南中保留并鉴定其中的几个。

参考资料

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