【6.7.1】CRISPR脱靶预测经验

很难清楚地预测脱靶位点的实际切割，因为它可能高度依赖序列和基因座可及性。

• https://zlab.bio/guide-design-resources 可以预测目标基因座的位置，但要检查的地方很多，因为在3x10^9 bp基因组中，与20 bp序列的近亲很有可能。
• 在某些情况下，单个错配会导致sgRNA诱变效率下降，而在其他情况下，可以容忍3至4个。 （这是对要测序的DNA进行测序的最佳理由，以设计指南，而不是依赖数据库的gDNA序列来避免对SNP不匹配的靶的效率损失）。

但首先，对脱靶的关注有所改变，这取决于您要在其上应用CRISPR / Cas9工具的模型。如果在细胞上，脱靶确实将是一个重要的问题，如果在鼠上，尽管backcross 时间很长（并且只要可能的脱靶不会影响目标受精卵开发，则可以通过backcross 摆脱脱靶突变。

但是，有一些经验法则：

• 接近PAM的错配（5'-3’的11-20位核苷酸）比可耐受得多的指导序列的nt1-10的错配更能降低Cas9 DNA的切割活性。我想说的与PCR引物在3’末端退火失配类似。
• 双切口使目标切割的断裂下降到NGS的检测水平以下，并且当不引导向导驱动wt Cas9时，可能由于DSB可能改变了单个靶位，这是因为单个向导携带单个切口酶的诱变性可能要低得多而不是NHEJ，通过碱基切除修复技术进行了高保真修复。

请参见Zhang和Church实验室的论文，Cong 2013，Ran 2013，Mali 2013。

顺便说一句，根据一些DNA修复专家的说法，DSB的NHEJ修复不像在CRISPR / Cas9诱变中那样具有诱变性（并且如在VDJ重组中得到适当控制时具有很高的特异性）。人们认为，存在于DNA上或在DSB后停留的空间较大的Cas9（〜160 kDa）可能会加剧CRISPR / Cas9方法中的诱变NHEJ修复。因此，对于在某些情况下可能在SSB修复过程中促进诱变事件的切口酶也是如此。综上所述，请记住，低于NGS的检测水平并不意味着零。

• 使用重组Cas9和体外合成的sgRNA进行转染或核转染比在用PX系列质粒转染时在细胞中产生的Cas9少得多。有关其Alt-R系统的信息，请参阅IDT文档。人们认为，使用更少的Cas9可以在更短的时间内降低偏离目标的风险。

最后，避免出现脱靶问题的最佳方法是应用良好的实验设计和控制规则，与siRNA shRNA时代相比，CRISPR新颖性没有改变。使用多个指南，例如至少两个指南，它们的序列明显不同，因此与靶位点不同，如果要生成克隆，请在每个指南中保留并鉴定其中的几个。

参考资料

• https://www.researchgate.net/post/Best_tool_to_predict_off-targets_in_CRISPR_How_many_mismatches_are_considerable