【3.2.3】核糖体图谱分析Ribosome profile(Ribo-seq)

在细胞内存在着成千上万种不同的蛋白质,几乎所有生命活动的执行都离不开它。蛋白质是从mRNA翻译而来。然而,转录组数据和蛋白质组数据的相关性却很低,原因在于从转录组到蛋白质组要经历一个复杂且精细的调控阶段——翻译调控(Translation Regulation)[1]。对翻译调控的研究即为翻译组学,包括但不限于核糖体、正在翻译的mRNA(translating mRNA)、tRNA、调控性RNA(如miRNA、 lncRNA等)、新生肽链(nascent polypeptide chain)、各种翻译因子等。翻译组测序Ribosome Profiling(或称Ribo-seq)是针对与核糖体结合,长度约为30nt,正在翻译的mRNA片段进行富集、测序和定量(图1)[2-4]。据此获取每种转录本上核糖体的分布,并可推测起始密码子位置(包括非ATG起始)以及uORFs,并可进一步分析翻译效率,解析翻译调控机制。

核糖体图谱分析(Ribosome profiling),是翻译调控主要技术手段之一。这一方法促进发现在多样化和复杂的生物过程中的基因表达的调控,是蛋白质合成机制、甚至是新蛋白质的重要方面,为编码区域的实验注释提供了一个系统化的方法。

本文主要讨论核糖体图谱的方法原理,其优势和局限性,以及核糖体图谱分析这一方法作为指导生物发现关键因素的一些例子,包括在识别成千上万个新翻译的sORF和翻译替代产物中的突出作用。

一、研究方法

核糖体图谱分析是通过RNA酶处理细胞裂解物,把不受核糖体保护的RNA降解掉,然后应用蔗糖离心的方法,分离被核糖体保护的mRNA片段。通过这一实验处理可得到30个核苷酸左右的"Footprints",可将其直接map到原始的mRNA,用于确定翻译中的核糖体的准确位置。

核糖体足迹(Ribosome footprints)用于构建链特异性文库并进行高通量测序,再将这些测序片段map到合适的基因组上。通过对蛋白合成的比率和mRNA的丰度比较,可使得检测每个mRNA的翻译效率成为可能。

图1 Ribosome profiling与mRNA-seq研究步骤对比

二、核糖体图谱分析的优势

(1) 可准确定量

核糖体图谱分析可对不受干扰细胞的翻译过程的检测和定量提供一个较大的动态范围。这一方法的灵敏度,取决于样本的测序深度,即使一些罕见的翻译事件也可促进相对定量。

(2) 可精确定位

除了具有较大的动态检测范围之外,核糖体图谱分析可提供精确的位置信息。核糖体图谱位置分析可用在翻译调查方面,到目前为止可用来鉴定许多新的核糖体移码突变,终止密码子通读,核糖体暂停,在非AUG密码子和uORF翻译区的翻译起始。

(3) 瞬时测量

当细胞蛋白质发生表达时,核糖体图谱分析就可灵敏检测到。核糖体图谱分析和mRNA-seq的定量反应了转录本的丰度与瞬时蛋白合成的速率不是正相关的。对转录本丰度和蛋白合成丰度的定量检测,可推断相对的翻译效率。翻译效率同时也会随着mRNA实时发生变化,反应了在翻译水平上的一个动力学调控。

三、核糖体图谱分析的局限性

(1) 实验上的局限性

核糖体图谱分析的主要技术挑战是需要在一个特定的生理学状态下,快速抑制翻译来捕捉核糖体快照。

(2) 需要推断蛋白合成速度

这一方法准确的前提是所有的核糖体都已经完成了翻译,通常细胞中不同mRNA的翻译延伸速率是相似的。

(3) 污染的footprint-sized片段

污染的RNA片段(包括non-codingRNAs或核糖体蛋白复合物)在核糖体的蔗糖梯度中迁移,因此可能会在核糖体图谱分析的文库中存在,并且导致翻译中错的读取。

(4)不明确的mappingreads

在基因组测序或mRNA-seq中,较长的reads可以帮助更好地进行mapping到正确的位置,核糖体图谱分析中产生的约30bp的核苷酸的短序列不容易mapping。

(5) 材料的数量

与mRNA-seq相比,核糖体图谱分析的主要限制是需要相对大量的样品。与mRNA-seq相反,核糖体图谱分析目前对单细胞不适用。

四、小结

核糖体图谱分析可对细胞内的翻译进行精确的定量,可提供测量每个蛋白质合成的多少,翻译是如何调控,以及翻译合成的启动和终止位置。核糖体图谱分析的丰度和定量分析数据提供前所未有的机会去探索和模拟复杂的细胞过程。

基于核糖体图谱分析提供的在基因组上的精确位置信息,可在实验上确定基因组的蛋白编码能力。因此可对大量的非标准的翻译事件进行鉴定,包括翻译中新的sORFs,以前已注释蛋白的不同形式,从而挑战传统的蛋白编码区域和基因多样性的观点。信息分析的进步可加速对其他非标准翻译事件的鉴定,比如移码转换,和终止密码子通读将会延伸我们对复杂的基因组的编码蛋白质的能力的理解。核糖体图谱分析也将推进其在复杂系统中的应用,包括核糖体亚基的分析,与特定因素相关联的分析、蛋白质修饰,或是特定类型的细胞或亚细胞位置的分析。

参考资料

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