【3.3.1】反相离子对色谱法 Reversed phase ion pair chromatography (RP-IP)

20 世纪 60 年代初,Schill 等人对两个相反电荷的离子相互作用形成一个中性化合物的现象进行了 系统研究,并把它引入到液相色谱中,这是最早的离子对色谱法。20 世纪 70 年代初,发展起来了现代 离子对色谱法,早期的反相离子对色谱主要用于液—液分配色谱(固定液涂渍与载体上)。20 世纪 70 年 代中后期随着化学键和固定相的发展,离子对色谱不再使用涂渍型填料,而使用现在最常用的反相离子 对色谱。离子对色谱主要分为两类:正相离子对色谱和反相离子对色谱。因为正相离子对色谱法现在已 经很少使用,故只介绍反相离子对色谱法。

一离子对色谱法的基本概念

离子对色谱法(ion—pair chromatography,IPC)是用正相或反相色谱柱分离离子型化合物和可解 化合物的方法(counterion)与离子化的样品组分形成离子对,这种离子对同中性或非极性分子一样,可 采用分配色谱的方法进行分离。

二、反相离子对色谱法

反相离子对色谱法是把离子对试剂添加到极性流动相中,被分析的样品离子在流动相中与离子对 试剂(反离子)生成不带电的中性离子对,从而增加了样品离子在非极性固定相中的溶解度,是分离系 数增加,改善分离效果。

2.1 反相离子对色谱的原理

在阐述离子对色谱的保留机制时,有多种模型理论,主要理论有离子对模型和动态离子交换模型, 本书介绍离子对模型 。 离子对模型认为,在反相离子对色谱中,固定相为疏水性的键合相(如 ODS),被分离的离子和反 离子同时存在于强机型的流动相中两者生成的中性离子对在流动相和键合相之间进行分配,可采用分配 色谱的方法进行分离。

对于碱性化合物(B),一般用各种烷基磺酸盐(R—SO3 Na)作离子对试剂,流动相和固定相之 间的反应如图 11—1 所示。

图 11—1 碱性化合物形成离子对示意图

对于酸性化合物(RCOOH),一般用各种季铵盐,如四丁基铵类(TBA +X ­ ),作离子对试剂,流动 相和固定相之间的反应如图 11­2 所示。

图 11—2 酸性化合物形成离子对示意图

当中性离子对在固定相和流动相之间分配平衡之后,分配系数与离子对试剂碳链长度及被分离组 分极性等因素有关。离子对试剂碳链长度越长,分配系数越大,保留时间越长。

2.2 影响反相离子对色谱保留的因素

反相离子对色谱常用的流动相是甲醇—水、已腈—水,流动相中一般含有 3~10mol/L 的离子对试 剂。在反相离子对色谱中,流动相的 PH 值、离子对试剂的种类和浓度、有机溶剂的种类和浓度、缓冲 盐、柱温等因素都会对分离产生很大影响。

1.流动相的 PH 值,合适的 PH 是离子对色谱的重要条件,它将决定离子化合物的解离度为了使化 合物有最大程度的解离,获得合适的保留与响应,但又不能超出硅胶基质的色谱柱所能承受的范围,一 般 PH 为 2~7.5。 分离强酸性药物,在低 PH 值也能充分解离,故对 PH 值要求不严;对于弱酸性药物,如磺胺类、 巴比妥类药物等,需在高 PH 值时才能充分解离,若 PH 值过低,则抑制解离,样品组分呈不解离溶质, 故这些药物不太适合采用离子对色谱分析。碱性试剂的分析可控制在较低 PH,能在色谱柱适应的范围 内较方便的进行离子对色谱分析。

由酸碱平衡可知,流动相的 PH 值影响酸碱化合物基离子对化合物的解离。为了使酸碱化合物获得 最大保留, 应选择 PH≈ (pKa+2) 的流动相, 使其完全解离为 RCOO ­ 。 对于碱性样品, 应选择 PH≈ (pKa­2) 的流动相,使其解离为 BH +,从而是样品离子于离子对试剂形成中性离子对化合物而保留。

2.离子对试剂的类型,离子对试剂的种类决定于被分离样品的性质,通常选用与被测样品电荷相反 的离子对试剂。标 11­1 列出了常用的离子对试剂及其主要应用对象。

对于同一类别的离子对试剂,其碳链长度不同,疏水性也不同。离子对试剂的碳链越长,所形成 的离子对越易在固定相上保留;反之,碳链越短。离子对的保留值越小。

离子对试剂种类不同,其所形成的离子对在固定相上的保留程度也不同:

  1. 同一类离子对试剂中,亲水性基团(如—OH、—COOH、—NH2)数目越多,形成的离子对 的保留值越小;疏水性基团(如芳基)数目越多,形成的离子对的保留值越大。
  2. 对于烷基胺(铵)类离子对试剂,所形成的离子对保留顺序大致为季铵离子<伯胺离子<仲胺 离子<叔胺离子。
  3. 对于无机阴离子不同的同一类离子对试剂,所形成的离子对保留顺序为 Cl ­ <Br <I ­ <ClO4 ­ 3.离子对试剂的浓度, 当流动相中离子对试剂的浓度增加, 被固定相吸附的离子对试剂浓度也增加, 直至固定相上离子对试剂饱和。由于样品的保留主要取决于吸附在固定相上的反离子的浓度,因此,随 着流动相中离子对试剂的逐步增加,样品的保留也逐步增加到一极大值,若继续增加离子对试剂浓度, 样品的保留不但不增加,反而减少。这是因为离子对试剂的反离子,如四丁基氯化铵(TBA +Cl ­ )中 Cl ­ 与样品离子(COO ­ )竞争保留在(TBA +)上,故一般流动相中的离子对试剂浓度为 3~10mol/L。

4.有机改性剂的性质和浓度,在反相离子对色谱中,样品组分的 k 值变化还与流动相中有机改性剂 的性质和浓度有关。有机溶剂类型可能改变选择性,但同时要考虑到离子对试剂的溶解度。多数季铵盐 和磺酸盐可溶于甲醇,而在已腈中的溶解度较差,若增加已腈中的含水量(约 10%~20%),溶解度会增 加;十二烷基硫酸钠在已腈中的溶解度大于甲醇中的溶解度。

增加流动相中有机溶剂的比例,吸附在固定相上的离子对试剂减少,因而可以选择性的降低离子 型化合物的保留,有机溶剂的比例越高,k 值越小。被测组分的疏水性和离子对试剂的疏水性越强,所 需有机改性试剂的浓度越高。一般调节有机溶剂的比例是化合物的保留在 0.5<k<20 范围内。

此外,增加流动相中缓冲盐的浓度,保留样本下降。在进行离子对色谱时,应特别注意色谱系统 的恒温条件,以保证分离的重现性。

三、应用示例

反相离子对色谱法可以用于分离鉴定季铵盐类、胺类、氨基酚类、羧酸类等药物,尤其是在反相 色谱系统中不保留或几乎不保留的酸性药物,如盐酸二甲双胍、左(旋)卡尼汀等。

在体内药物的分析中,采用分析离子对色谱法可使极性很大的药物保留值增加,使待测药物与内 源性物质能很好的分离。陈钧等一磷酸四丁基铵为离子对试剂,测定人血浆中的烟酸。在体内药物分析 中采用分析离子对色谱以提高分离选择性的方法同样也适合于极性并不大的酸性或碱性药物,如李春盈 等以十二烷基硫酸钠为离子对试剂测定了尿液中帕珠沙星浓度。

离子对色谱法无论是在药物的原料和制剂的含量测定,还是在有关物质的检查中都可以起到重要的作用。向流动相中添加某些离子对试剂科使某些极性较强的成分或杂质保留时间延长,柱效提高,或 使主峰与相邻杂质分离度符合要求,且能检查到较多杂质,使方法具有较好的装属性。郭黛苹等以庚烷 磺酸钠作为离子对试剂,用多选离子对高效液相色谱法检测肾上腺素与肾上腺酮。赵雪梅等以庚烷磺酸 钠为钠离子对试剂测定羧甲司坦的含量及有关物质。

【例 11­1】离子对反相 HPLC 法测定盐酸二甲双胍含量及有关物质

盐酸二甲双胍(1,1­二甲双胍盐酸盐,metformin hydrochloride)是一种疗效较好的降血糖药。其 结构见图 11­3。

图 11­3 盐酸二甲双胍结构式

二甲双胍极性较大,在 C18 柱上几乎不被保留,所以采用普通 HPLC 对其进行定量分析及其有关物 质检查又一定的难度,若在流动相中加入离子对试剂十二烷基磺酸钠后,二甲双胍在色谱柱上的保留大 大增加。本例介绍盐酸二甲双胍的离子对反相高效液相色谱测定法。

色谱条件:采用 InsertsilC18 色谱柱(5 u m,4.6mm×150mm) ;以甲醇—5mmol/L 磷酸二甲溶液 (含有 10mmol/L 十二烷基磺酸钠,用磷酸调节 PH 至 3.5+ _ 0.05),(64:36)为流动性;流速:1.0ml/min; 紫外检测波长:330nm;柱温:室温。七色谱图如图 11­4 所示。

方法解析:在色谱条件中,用磷酸调节流动性 PH 至 3.5+ _ 0.05,其目的在于使二甲双胍结构中的 氨基质子化,从而使其可以与离子对试剂十二烷基磺酸钠形成离子对。十二烷基磺酸钠分子结构中的十 二烷基碳链的疏水性可以使二甲双胍离子对的色谱保留大大增加。

【例 11­2】离子对反相 HPLC 法测定左卡尼汀片的含量

左(旋)卡尼汀(L­carnitine)又名 L­肉碱,是一种生物体自身合成的生理活性物质,其主要的功 能是促进脂类代谢,临床上主要用于继发性肉碱缺乏症,其结构见图 11­5.

左卡尼汀为酸碱两性药物,极性很大,在 C18 柱上无法被保留,所以采用反相 HPLC 对其进行定 量分析是不可能的。本例介绍左卡尼汀的离子对反相高效液相色谱测定法。

色谱条件:色谱柱为 C18 Hypersil,250mm×4.6mm,5 m m;以 0.05mol/L 磷酸盐缓冲液(PH 为 2.0,含 1‰庚烷磺酸钠)—甲醇(98:2)为流动相,流速 1ml/min;检测波长为 210nm。其色谱如图 11­6 所示。

图 11­5 左卡尼汀结构式

方法解析:在色谱条件中,用磷酸调节流动相 PH 值至 2.2,以抑制左卡尼汀结构中羧酸基的解离, 起到离子抑制的作用。同时在流动相中加入庚烷磺酸钠,使其与左卡尼汀结构中原本带正电荷的季铵形 成离子对,从而使左卡尼汀的色谱保留大大增加。

参考资料

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