【8.3.2.1】优化splint

RNA 片段与互补 DNA 夹板杂交形成三元连接感受态复合体 (LCC, ligation-competent-complex),然后由 DNA 连接酶翻转( turned over)。

总之,使用长夹板是一种普遍适用的方法,可以克服高度结构化的 RNA 杂交的低倾向,从而显着提高连接效率

全长产物的产率随着夹板长度的增加而增加,73mer夹板的产率增加到29%(40mer)和36%(50mer),达到41%

大多数实验论文以及一些关于通过 T4-DNA 连接酶进行夹板介导的连接的方法评论论文都推荐:

  1. 总长度为 15-30-nt 的夹板,每个 RNA 片段跨越 8 到 15 nt(Strobel 和 Cech 1993;Reed 和基亚拉 1999 年;摩尔和查询 2000 年)。
  2. 虽然一些作者建议更长的寡核苷酸延伸到 15-20 nt ( Yu 1999 ; Frilander and Turunen 2005 ) 或更长 ( Moore and Query 1998) 在连接位点的任一侧,未给出实验数据。

在目前高度结构化的 RNA 的两种情况下,在 30°C 下,30 聚体夹板的连接效率低下,但 40 聚体夹板的连接效率显着提高,因此确定了每个 RNA 片段的互补序列在 15 到 20 nt 之间的临界阈值。该阈值在较低的温育温度下可能较低,如 15°C 下 30 聚体夹板的连接产量增加所示。无论温度如何,目前的研究都支持选择最大长度的夹板寡核苷酸,原因有几个。类似于先前报道的破坏寡核苷酸的使用(Strobel 和 Cech 1993) 旨在破坏 RNA 底物中的三级相互作用,较长的夹板 DNA 往往会破坏 RNA 片段中二级结构的特征。

LCC 的一般稳定性导致 (1) LCC 的产量增加和随后的连接产物;(2) 分离出稳定的 LCC 的可能性;(3) 减少不能连接的中间体;(4) 保护稳定的 DNA-RNA 双链体中的连接产物免于降解。

参考资料

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