【3.2.2】通过蔗糖梯度分级(Sucrose Gradient Fractionation)对 mRNA 翻译进行分析

从 mRNA 分子产生蛋白质的效率可能因转录本、细胞类型和细胞状态而异。准确测定 mRNA 翻译效率的方法对于获得对转录后基因调控的机制理解至关重要。测量翻译效率的一种方法是确定与 mRNA 分子相关的核糖体的数量,归一化为编码序列的长度。这种分析单个 mRNA 的主要方法是蔗糖梯度分级,它根据结合核糖体的数量物理分离 mRNA。在这里,我们描述了一个简化的协议,用于准确分析 mRNA 与核糖体的关联。与之前的协议相比,我们的方法结合了内部控制和改进的缓冲条件,共同减少了由非特异性 mRNA-核糖体相互作用引起的伪影。此外,我们的直接从馏分 qRT-PCR 协​​议消除了从梯度馏分中纯化 RNA 的需要,这大大减少了所需的动手时间,并促进了多个条件或基因目标的并行分析。此外,在此过程中不会产生苯酚废物。我们最初开发了协议来研究酿酒酵母中的HAC1 mRNA ,但我们还详细介绍了哺乳动物细胞系和组织的改编程序

一、背景

mRNA 向蛋白质的翻译是一个高度受管制的过程,根据基因、细胞环境或环境的不同,可以以不同的速度发生。翻译的每一步——起始、延伸和终止——都可以成为最终影响与 mRNA 相关的核糖体数量的调节点(Dever 和 Green,2012;Hinnebusch 和 Lorsch,2012)。由于连续起始事件之间的时间通常比延伸所需的时间短,因此大多数 mRNA 一次与多个核糖体相关联以形成“多核糖体”(polysome)结构(Warner等., 1963)。因此,计算每个 mRNA 分子核糖体数量的能力提供了对 mRNA 整体翻译状态的分析。

  • 传统上,这种计数是通过蔗糖梯度分级(有时也称为多核糖体分析)实现的,其中 mRNA 根据其大小/形状通过超速离心分离,然后进行量化(Mašek等,2011)。可以通过 RNA 印迹或 qRT-PCR 对单个 mRNA 或通过微阵列或高通量 RNA 测序对整个转录组进行梯度级分中 mRNA 的检测(Arava等人., 2003; Floor 和 Doudna,2016 年)。通过这种方式,可以确定与单个 mRNA 分子相关的核糖体的绝对数量。
  • 另一种检测翻译的方法是核糖体足迹分析,其中捕获受核糖体核糖体酶消化保护的 mRNA 短片段并进行高通量测序(Ingolia等,2009)。当结合总 RNA 测序来确定 mRNA 丰度时,核糖体分析数据可以以全基因组的方式测量 mRNA 的翻译效率。然而,核糖体分析仅提供翻译效率的相对测量,可能会受到 RNA 丰度测量的影响(Weinberg等人., 2016)。此外,核糖体分析不太适合低丰度 mRNA 的研究,或者当只有少数 mRNA 感兴趣时。

由于这些原因,蔗糖梯度分级仍然是分析翻译效率的重要工具。

我们介绍了这种广泛使用的技术的改编版,其中包含了提高准确性和减少动手时间的关键功能。通过蔗糖梯度分级分离的 mRNA 多核糖体分析分三个步骤完成:

  1. 裂解物制备、
  2. 蔗糖梯度分级分离
  3. RNA 丰度分析。

我们的协议最初是为了简化对多个 RNA 的并行分析而开发的,但在协议开发过程中,我们还仔细优化了每个步骤,以确保该测定提供了准确且可重复的核糖体关联测量。我们为芽殖酵母S. cerevisiae开发了方案(Di Santo等人,2016 年),但此后也将其应用于各种人类和小鼠细胞系,甚至整个小鼠组织(Odegaard等., 2016)。我们协议的一个关键特征是在裂解缓冲液中加入肝素,这减少了 mRNA 和核糖体之间的非特异性相互作用,否则可能导致未翻译 mRNA 与多核糖体的人工共沉淀。我们还对未翻译的 RNA 进行了可靠的控制:一种未加帽的外源 RNA,在超速离心前加入裂解液中。对于 RNA 分析步骤,我们采用了以前用于细胞裂解物的 qRT-PCR 试剂盒,直接使用梯度级分,从而消除了之前所有多核糖体分析协议中使用的耗时的 RNA 纯化步骤。直接从粗梯度馏分中测量RNA 丰度不仅减少了时间要求和手动操作,而且消除了苯酚废物的产生。最后,为了控制级分(蔗糖浓度和大分子组成不同)之间 RT-PCR 效率的变化,我们在收集后立即向每个级分中加入等量的人工 RNA,作为标准化参考。总之,我们的协议(在下面详细介绍)包含一系列改进和内部控制,它们共同为多核糖体分析提供了准确、简化的分析。

二、分析流程

Figure 1. Workflow schematic of the sucrose polysome gradient protocol from multiple cell types

图 2. 从该 polysome 梯度分析协议生成的代表性数据。顶部面板显示 A 260分馏酵母裂解物的吸光度曲线,并标注了与每个峰相关的核糖体种类。下图显示了与通过 qRT-PCR 分析的梯度的每个部分相关的 RNA 相对分布的代表性图。代表的是翻译抑制的 mRNA(橙色)、翻译良好的 mRNA(蓝色)和未加帽的荧光素酶 RNA(绿色),用作非特异性相互作用的对照。翻译良好的 mRNA 主要是多聚体和沉淀物,位于管底部的梯度深处。翻译抑制的 mRNA 和外源对照 RNA 都与核糖体无关,并保留在顶部部分。

(sam点评:这个图的横坐标代表什么呢????)

参考资料

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