【3.2】nanopack--数据质控分析
当前nanopore测序质量虽然有很大的改善，但准确性依然不及二代测序，例如illumina或者BGIseq等。前面介绍过，目前主流的R9.4芯片准确性在92%左右，下面是百迈克公司发布的一些nanopore测序数据的情况，我们看到当前nanopore测序平均Q值在7以上，Q7可以作为数据过滤的一个标准，平均长度可以在20K以上。
表1百迈克公司发布nanopore测序数据情况
注：Species：分析的物种信息；SeqNum：各个长度范围内序列的数目；SumBase：指各个长度范围内序列的总长度；N50Len：reads N50长度；N90Len：readsN90长度；MeanLen：平均reads长度；MaxLen：最长reads长度；MeanQual：质量值，准确度=1-10^(-Q/10)
虽然前面我们介绍过可以使用minion_qc处理sequencing_summary.txt文件进行绘图，但这是对结构化的统计表进行处理，而更常见的情况是需要对fastq文件进行处理。nanopack软件包可以用于nanopore数据的各种处理，里面包含了NanoComp，NanoFilt，NanoGUI，NanoLyse，NanoPlot，NanoStat等工具包，可以使用pip直接进行安装，一些工具也可以使用bioconda来安装，不过工具包中并不包括nanoQC，nanoQC需要单独安装。软件需要python 3以上版本，因为python的版本问题可能导致安装不成功，所以建议利用bioconda虚拟环境来进行安装使用。
一、安装nanopack软件
软件官网：https://github.com/wdecoster/nanopack
虚拟环境安装
conda create -y -n nanopack
conda activate nanopack
conda install -c bioconda nanoqc nanoplot nanostat nanofilt
conda deactivate nanopack
安装的工具路径：
(nanopack) [sam@c01 1.analysis]$ ll /data/software/miniconda3/envs/nanopack/bin/ |grep Nano
-rwxrwxr-x 1 sam sam 256 Aug 9 14:31 NanoFilt
-rwxrwxr-x 1 sam sam 256 Aug 9 14:31 NanoPlot
-rwxrwxr-x 1 sam sam 256 Aug 9 14:31 NanoStat
(nanopack) [sam@c01 1.analysis]$ ll /data/software/miniconda3/envs/nanopack/bin/ |grep nano
-rwxrwxr-x 1 sam sam 252 Aug 9 14:31 nanoQC
二、利用 nanoQC数据质控
软件安装完成之后就可以使用NonoQC用于对nanopore测序数据进行质控，软件使用比较容易。
mkdir nanoQC
nanoQC ../2.rawdata/minion/all..fastq.gz -o nanoQC
-o /--outdir：输入结果目录
结果解析
nanoQC会生成两个文件nanoQC.html，NanoQC.log，其中nanoQC.html是一个网页文件，可以传到windows下用浏览器打开，主要是一些质控图，包括长度和质量的分布等。
如果需要统计信息，可以使用nanostat进行统计。
NanoStat --fastq ../2.rawdata/minion/all.sra.fastq.gz --outdir statreports
-o：输出结果目录
--fastq：输出fastq格式文件
--readtype {1D,2D,1D2}：测序数据类型
-p：输出结果前缀
参考资料
