【3.3】利用NanoPlot进行数据质控
对于二代测序，可以使用fastqc软件对数据进行全面的统计绘图。但是由于二代测序（主要指illumina）独特的特性，例如读长长度一致，有可能包含adapter和Duplication等。因此，虽然同样是fastq格式文件，但并不太适合用来处理nanopore数据，里面的一些质控指标并不适用。那么有没有类似于fastqc的软件来处理nanopore数据呢，目前看起来NanoPlot软件比较好用的nanopore数据质控软件。
一、NanoPlot 绘制质控图
NanoPlot可以用来对nanopore数据进行统计绘图，输入文件为fastq格式，绘图时需要调用NanoStat进行统计。NanoPlot利用这些统计信息进行绘图，最终会生成一个网页格式文件，包括序列读长的直方图、序列读长与序列平均质量的散点图等。同时，该软件也可以对guppy碱基识别后生成的统计文件sequencing_summary.txt进行绘图。
网址：https://github.com/wdecoster/NanoPlot
可以直接使用pip安装，不过由于python版本的问题，还是推荐使用bioconda来进行安装。
conda install -c bioconda nanoplot
二、使用案例
NanoPlot可以直接对guppy生成的fastq文件进行处理，同时也支持fasta格式，支持压缩格式，或者排序后的bam文件，如果有sequencing_summary.txt也可以直接进行绘图。
直接对fastq格式质控
NanoPlot --fastq ../2.rawdata/minion/all..fastq.gz -t 12 --maxlength 40000 --plots hex dot pauvre kde -o nanoplot
NanoPlot可以直接对guppy生成的sequencing_summary.txt的绘图。
Nanoplot –summary sequencing_summary.txt –loglength -o summary 选项参数：
-t：线程数目
-o, --outdir：输出结果目录
-p, --prefix：输出结果前缀
--color：点的颜色
--N50 表示在序列读长的直方图中显示N50的标识
--title：标题
--downsample ：在输入文件中随机抽取n条序列进行处理
--minlength：忽略nbp以下的reads
-- fastq：输入fastq格式文件
-f：图片类型
--plots：绘图类型，kde,hex,dot,pauvre
三、结果解读
NanoPlot输出结果主要是一些图片和一个网页文件，直接将结果拷贝到windows电脑上用浏览器打开网页文件即可。里面主要包括一些统计信息和可视化展示。对于nanopore数据来说，最重要的两个指标为长度分布与平均Q值，这些指标将用于下一步的数据质控操作。
表1 NanoPlot质控统计表
图1 长度与质量分布图
参考资料
