【3.1】类群特异性PCR引物设计-Primrose
类群特异性PCR引物( Group-targeted PCR primers) 指的是以一个类群( group) 生物共有的某一进化保守基因作为扩增产物的PCR引物。通过应用类群特异性PCR产物扩增环境宏基因组中该保守基因，并进行宏基因组学分析( DGGE-测序、TRFLP、454测序)，可以获得关于该类群遗传多样性的信息。为了保证结果全面而特异地反映该类群的多样性水平，类群特异性PCR引物需要具备区别于普通PCR引物的一些特性，以系统发育学研究中常用的核糖体RNA编码基因为例:
- 敏感性: PCR反应是以多来源rDNA而非单一来源rDNA作为模板，需要通过多序列全局比对寻找序列保守区间设计引物，以尽可能地保证引物能够扩增所有的目的来源 rDNA;
- 特异性: 多来源 rDNA中存在大量非目标扩增的rDNA，需要将引物与这些非目标扩增rDNA逐个进行两序列局部比对并汇总，排除非特异性扩增严重的引物
Primrose 是基于java的一个工具。
一、安装
linux下运行java程序
1.准备工作
JDK环境：java的安装可以见用blast2go的时候就已经弄好了，见博文：http://blog.sina.com.cn/s/blog_670445240101iy3d.html
一个可以行的java程序。例如abc.jar
2.一般执行
java -jar abc.jar
3.做成linux可执行文件执行
cat >> abc.sh
java -jar /usr/local/abc.jar
添加可执行权限
chmod +x abc.sh
3.加入linux任务计划中
crontab -e 编辑任务计划
添加
*/1 * * * * /usr/local/abc.sh 每分钟执行一次abc.sh
前5个参数依次 分钟 小时 日 月 周
*占位 / 表示每 1 表示在第1分钟 */1表示每一分钟
crontab -l 查看任务计划
二、使用
Primrose利用RDP数据库来设计引物
下载地址：http://mac.softpedia.com/get/Math-Scientific/Ashelford-Primrose.shtml
或http://mac.softpedia.com/get/Math-Scientific/Ashelford-Primrose.shtml#download
选择SoftpediaSecure Download(US)版本
具体使用说明： /Primrose_2.17/Primrose/docs/README.html，参见下面的那一篇文献更清楚一些
使用说明：java –jar Primrose.jar
1.构建数据库，确定目标扩增类群
load sequence files—选择数据库文件—看到每条被导入的序列，可以选择性的删掉不想要的序列，然后accept。
Use this dialog to select an RDP release 8.1 database (files withsuffix .phylo), or any number ofGenBank (.gb) or Fasta (.fas) formatted files. RDP files can be found in the databasedirectory that is included with the program.
这个工具只能识别上面的三种格式。我将silva.seed_v119.align改为了silva.seed_v119.fas。
If there are records youwish to exclude, left mouse click (Windows, Linux) or mouse-click + Ctrl (AppleOsX) the record (or group of records) to exclude
需要注意的是Primrose在构建数据库时，需要将目的扩增数据库与非扩增数据库分别置于不同的文件中，否则会出现警告而终止程序。
2.specify target taxon 生成备选引物
在构建数据库并确定目标扩增类群之后，将通过 Primrose 获得备选引物。为了平衡引物的敏感性和特异性，以寻找到更合适的类群特异性引物，选择以下 2 种方式生成备选引物: (1 ) 选取不同真核藻类门类的序列作为备选引物设计来源，以保证引物的高敏感性; (2) 选取某一真核藻类门类的序列作为备选引物设计来源，以保证引物的高特异性选择序列left-mouse clicking (Windows, Linux) or mouse click + Ctrl (AppleOsX)
3.筛选备选引物
命中数 目标库内命中数 占库内总数% 目标库外命中数 占库外总数%
参考资料：
文献：《类群特异性PCR引物 真核藻类 Primrose S rDNA通用引物》超赞
