转录组介绍

转录组（transcriptome）,额定类型细胞中全体转录本（transcript）的集合，是细胞特定时刻基因表达谱的一个快照（snapshot of expression profile）。在转录组中，既包括编码蛋白的信使RNA(mRNA),也包括不编码蛋白的mirRNA,long non-coding RNA(lncRNA)等非编码RNA。这些RNA转录本彼此协同作用，共同来调控细胞的生长，发育，凋亡等一系列重要的生理过程。因此，对于转录本的研究通常包括定性和定量两个方面。

Real-Time qRT-PCR通过对经典PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，我们可以实现对其实模板的定量分析。通过正确设定引物（primer）和探针（probe）,qRT-PCR技术可以很大范围内定量的检测目标转录本的拷贝数，也即表达水平。因此长被作为转录组分析中的金标准（Gold Standard）.qRT-PCR只能测定一个转录本的表达水平，同时也需要知道待检测转录本的序列，难以用来发现未知的转录本。

Microarray在高通量测序之前是主要的高通量转录本表达分析技术。微阵列（microarray），也称基因芯片（gene chip）,通过将几十万个不等的探针（probe）分子固定在约1cm见方的固体片基上制成的。利用核苷酸分子在形成双链时碱基互补配对原理，microarray可以一次性检测出样本中所有与探针互补的核苷酸片段，从而快速得到样本中基因的表达谱（expression profile）,因此，microarray从上世纪90年代问世以来，在生物，医学，农学等领域快速获得了广泛应用。与qRT-PCR相比，micoarray虽然在通量上有了显著的提高，但仍然需要实现确定待测转录本的序列。

EST(表达序列标签)技术通过对一个随机选择的cDNA克农进行单次测序来获得cDNA的部分序列。与microarray不同，EST是基于测序的，并不需要事先知道待检测转录本的序列。可以被用来发现新的转录本。早在1991年，当时还在NIH的Craig Venter等就开始利用EST来寻找人类的新基因。然而，由于当时测序技术通量的限制，一次EST通常只能得到几千个转录本的序列，远远无法进行全转录本水平的profiling.

RNA-seq深度测序技术的出现，使得研究人员首次可以，在全转录组水平利用测序技术同时进行定量与定性的分析。首先，对生物样品中的RNA反转录为cDNA而后将这些cDNA打碎成较小片段后，上机测序。一方面，RNA-seq技术使得研究人员可以快速确定转录本，进而鉴定存在的可变剪切体（Alternative splicing isoform）,这是传统的microarray等技术很难做到的。另一方面，对基因组特定位点上reads深度的计算，可以对表达量水平进行估计。所以，RNA-seq技术使得研究人员可以同时对转录组进行定性和定量的研究。需要注意的是，RNA-seq本质上是对转录本序列的随机抽样（random sampling）,因此，其检测效力（power）和灵敏度（sensitivity）高度以来于测序深度。如果测序深度不够，就难以检测出低拷贝的基因。原则上，只有在饱和曲线（saturation curve）达到平台期（plateau）后，才能认为深度足够。对于哺乳动物转录组来说，一个经验规则是通常要做到100-150X的coverage

在随机抽样的情况下（random sampling）情况下，map到转录本上的read数目正比于其表达量（transcript abundance）,因此，我们可以利用落在某个转录本上reads的总数目来估计其表达量。但另一方面，落在一个转录本上reads的书面，也于其长度和总测序深度成正比。例如有A,B两个基因，假定他们表达量相同，都转录2个转录本，但是A的长度是B的两倍，那么map到A的热啊但是数目就是map到B的reads数目的两倍。如果我们只是看这些reads的数目，我们会认为A的表达量是B的两倍，但这显然是不对的。

通量，测序深度。

所以，我们在实际分析中，通常会将原始的reads数目（raw reads count）利用线性放缩（scaling）,转换为RPKM值来进行归一化（normalization）处理。

RPKM就是一个常用的归一化的方法。 这个公式里面的C是贴到这段转录本上reads的总数目，N是这次试验总reads数目（也就是测序深度），L是这段学列的长度。在假定不同样本中RNA总体分布一致的前提下，RPKM就可以正确处理由于转录本长度和测序深度引起的artifact，从而使得来自不同基因，不同sequencing run乃至不同样本之间的表达数据彼此之间可以比较。需要注意的是，RPKM并不是唯一的归一化方法。通过考虑不同的误差因素（bias effectors）,引入不同的生物学假设，可以构造不同的归一化方法。事实上，已有研究表明，相比于后续提出的TMM,DESeq等方法，RPKM方法在样本差异基因表达检验等分析中的效果不是最理想。另一个需要在RNA-Seq技术中引起注意的地方是链特异性（strand-specific）。我们知道，DNA的两条链都可以转录，形成不同的转录本，然而，常用的Illumina RNA-Seq kit是不分链的，也就是说，我们无法知道配对的reads哪个方向和转录本是一致的，那个和转录本方向互补。对于分链的数据，又有两种不同的情况。在利用dUTP技术进行标记（labeling）的方法–也就是illumina的strand-specific kit 使用的方法中，第二个read和转录本方向一致，的一个read和转录本反向互补。在另一种SOLID等平台常用的secondstrand分链方法中，就刚好反过来了。因此在分析之前，我们一定要弄清楚自己的数据有没有分链，是怎样分链的。

参考资料：

此博文内容来自高歌老师的讲课