单细胞免疫组库测序建库

这篇我们将给大家图解10x genomics 免疫组库建库原理。免疫组库测序时一般会同时测V(D)J 区段的全长序列和5’端转录组。

在介绍免疫组库建库原理之前，我们简单介绍一下免疫组库测序有关的免疫学知识。

一、背景知识

我们所说的免疫组库测序，实际上是测B淋巴、T淋巴细胞核，B细胞上负责识别并特异结合抗原的膜表面免疫球蛋白，我们称为B-cell receptor(BCR)，BCR是由两条重链和两条轻链组成。T细胞上特异识别并特异结合抗原的分子为T cell receptor(TCR), TCR分子也属于免疫球蛋白超家族, 由α、β两条肽链组成。编码BCR/TCR的4个基因簇V(可变区)、D（高变区）、J（编码蛋白连接v、c区的结合区）、C（恒定区） ，B(T)细胞通过V(D)J重组，使BCR/TCR基因序列极为丰富，但细胞只表达一种特定的BCR(TCR)，也就是只能识别一种抗原，如下图一( https://medicine.yale.edu/keck/ycga/sequencing/10x/singcellsequencing/ ）

图一中BCR和Antibody(抗体)的关系我们用图二( http://www.futureforum.org.cn/cn/nav/detail/456.html )展示，B细胞受到抗原刺激后增殖分化被激活，分化的其中一个方向是分化成记忆B细胞，另一个方向是分化成浆细胞。浆细胞合成抗体多肽并分泌到细胞外执行功能。所以BCR分为在B细胞膜上的膜型，和B细胞分化成浆细胞后产生的我们成为抗体的分泌型。

另外，受抗原刺激的成熟B细胞在生发中心进行增值分化的过程中VD区的基因可以发生随机突变，以使新克隆生成B细胞的BCR和抗原结合更紧密，如下图三（ http://www.futureforum.org.cn/cn/nav/detail/456.html ）

二、单细胞免疫组库构建

V(D)J序列多样性的集合我们称为为免疫组库（Immune Repertoire, IR）,通过高通量测序，我们可一次性获得大量单细胞的基因表达谱和免疫组库数据，从而实现单细胞分辨率上同时对基因转录本和免疫组库进行高通量测序。下面我们以图解形式介绍单细胞免疫组库构建原理：

1.B细胞或者T细胞里，V(D)J 区段是在mRNA 的5’端，所以和Gel Bead表面携带的Barcode和UMI所在的核算序列紧挨着的是mRNA的5‘端，以便捕获全长的V(D)J序列，如图四。

2.GEMs的生成，每个GEM里含有Gel Beads、单个细胞、酶的混合物，如图五。

3.Gel bead上的Barcode序列是怎样连接上RNA分子的5’端？

如图六所示，在每一个单独的GEM里，除了 Gel Bead表面携带的Barcode和UMI所在的核酸序列，还有游离的poly-dT作为引物来结合RNA 3’端 poly(A)尾巴来扩增得到全长cDNA，这一步是发生在每个GEM内部。

4.GEM裂解后，所有细胞cDNA混在一起进行扩增以达到建库要求，扩增后的产物分成2份或3份同时进行TCR/BCR的V(D)JJ文库构建和5’单细胞转录组文库构建，获得每个细胞表达谱和V(D)J全长序列。来自同一细胞的VDJ文库序列和转录组文库序列有相同的细胞标签(Barcode)，这样每个细胞转录组数据可以对应该细胞的V(D)J信息.

5.第一个文库：V(D)J建库构建

V(D)J建库要进行巢式PCR，我们先看一下什么是巢式PCR？

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。

图八 巢式PCR

图九 V(D)J建库进行巢式PCR

6.V(D)J 全长序列获得原理：

V(D)J的区段的长度通常是650bp左右，而二代测序双端测序最多可以测150x2=300bp的序列。但是有同一UMI的reads属于同一条mRNA 扩增而来，我们用下图粉红色的UMI Groups 为例，图解原理，见图十。

7.第二个文库：

5’端mRNA文库构建，参考单细胞建库技术详细介绍里文库结构介绍。

参考资料

• https://zhuanlan.zhihu.com/p/182573824?utm_source=wechat_session&utm_medium=social&utm_oi=812690586258796544&utm_campaign=shareopn
• Potent neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 identified by high-throughput single-cell sequencing of convalescent patients’ B cells. Cell, 2020.
• Selecting the Correct Single Cell Immune Profiling User Guide. https://support.10xgenomics.com/
• Practical guidelines for B-cell receptor repertoire sequencing analysis. Genome medicine, 2015.