【1.1】单细胞测序的新进展和医学应用
单细胞测序技术可用于检测单细胞的基因组，转录组和其他多组学。 它们可以显示各种细胞的差异和进化关系。 这篇综述介绍了单细胞测序技术的最新进展及其在肿瘤学，微生物学，神经病学，生殖，免疫学，消化系统和泌尿系统中的应用，强调了单细胞测序技术在这些领域中发挥的重要作用。
一、背景
单细胞测序技术是指对单细胞基因组或转录组进行测序，以获得基因组，转录组或其他多组学信息，以揭示细胞群体差异和细胞进化关系。传统的测序方法只能获得许多细胞的平均值，无法分析少量细胞并丢失细胞异质性信息。与传统测序技术相比，单细胞技术具有检测单个细胞间异质性的优势[1]，区分少量细胞并描绘细胞图。 2013年，它被评为“自然方法”作为年度技术[2]。但是，早期的单细胞测序由于成本高而限制了其广泛使用。但是随着研究的进展，开发了许多新的单细胞测序方法，这些方法降低了单细胞测序的成本门槛。如今，单细胞测序技术越来越多地应用于各个领域。这篇综述描述了单细胞测序方法的最新进展及其在肿瘤，微生物学，神经病学，生殖，免疫，消化和泌尿系统中的应用，并阐明了单细胞测序技术在基础和临床研究中的重要作用。
二、单细胞测序方法和最新进展
2.1 单细胞测序方法的发展
随着研究的不断深入，单细胞测序方法（图1）的功能不断增强，并朝着更低的检测成本发展，从而推动了科学家在单细胞水平上对分子机制的研究。 Vitak等[3]提出了一种单细胞组合标记测序技术（SCI-seq），该技术可以同时构建数千个单细胞文库并检测体细胞拷贝数的变化（表1）。该技术增加了检测细胞的数量，降低了文库的建设成本，在研究体细胞变异中具有重要价值。 Chen等。 [4]开发了一种新颖的单细胞全基因组扩增方法，可以以千碱基分辨率检测CNV，并且可以更有效地检测更多疾病中的突变（表1）。郭等。 [5]开发了一种单细胞多重测序技术（scCOOL-seq），可以同时分析单细胞染色质状态/核位定位，拷贝数变异，倍性和DNA甲基化，这可以表明染色质状态的不同功能和模式和DNA甲基化（表1）。 Casasent等。 [6]发明了一种地形单细胞测序（TSCS），可以为细胞提供准确的空间位置信息（表1）。该技术准确地在空间上测量和描述单个肿瘤细胞的特定特征，并有助于研究肿瘤细胞的侵袭和转移。 Demaree等。 [7]描述了一种高通量和低偏差的单细胞测序（SiC-seq）方法，该方法使用液滴微流控技术分离，扩增和编码单个细胞的基因组（表1）。这种方法可以对不同的细胞群体进行更广泛的基因组研究。由Han等人开发的Microwell-seq。是一个高通量，低成本的scRNA-seq平台[8]（表1）。与涂有油滴的单细胞测序技术相比，它不仅可以提高单细胞技术的检测丰度，而且可以将检测成本降低一个数量级。 Rosenberg等人的SPLit-seq技术基于低成本组合条形码的原理，可将单细胞转录组测序的成本降低至1美分。再次打破了单细胞检测的成本门槛[9]（表1）。
2.2 联合使用单细胞测序技术
单细胞测序检测成本的降低有利于其他技术与单细胞测序技术的结合，大大提高了单细胞检测的效率。 Datlinger等。 [10]将CRISPR筛选与单细胞RNA测序相结合以发明CROP-seq（表1），从而可以对复杂的调控机制和异质细胞群体进行高通量的功能分析。 Gasperini等。 [11]结合了CRISPRi和scRNA-seq，以促进对调控元件功能的研究以及调控元件和基因之间的相互关系（表1）。哈比卜等。 [12]将sNuc-Seq与微流体技术相结合，引入了一种低成本，高灵敏，高效的细胞分类单细胞核RNA测序方法，有望用于人类细胞作图项目（表1）。湖等。 [13]结合单核测序（snDrop-seq）和单细胞转座子超敏位点测序（scTHS-seq）创建了一个高通量测序平台，用于并行检测核转录本和表观遗传学特征（表1）。它提供了一种全面分析冷冻保存的人体组织样品中基因表达和调控的方法。
上述研究（表1）表明，单细胞测序技术不断更新和发展，为构建完整的细胞图谱提供了技术基础，极大地促进了单细胞研究过程。将来，集成多组学方法的单细胞测序技术可能会流行起来，在复杂器官和组织的单细胞研究，临床疾病的诊断和治疗中发挥越来越重要的作用。
三、单细胞测序应用
3.1 在癌症中的应用
研究表明，遗传或基因组变异可导致肿瘤组织内的细胞具有不同的遗传和表型特征，从而使肿瘤组织高度异质[14，15]。这种高度的异质性可能与肿瘤发生的机制[16]和转移的机制[17,18,19]有关，因此研究人员需要对肿瘤细胞进行更准确的分析。传统的测序方法只能检测细胞群体，获得一组细胞中信号的平均值，但是可以掩盖肿瘤细胞中的异质性。因此，传统的测序方法不能很好地研究肿瘤细胞。单细胞测序技术可以完美弥补传统测序方法的缺点。通过检测肿瘤细胞的异质性绘制肿瘤细胞和肿瘤微环境的细胞图。此外，弄清肿瘤组织内的细胞群并找到特异性标记，并解释一系列问题，例如肿瘤发生和转移。因此，单细胞测序技术被广泛用于各种肿瘤的研究中，对于开发新的诊断和抗肿瘤治疗方法具有重要意义（图2）。
3.1.1 大肠癌
张等[20]通过单细胞测序技术绘制了大肠癌T细胞免疫受体的图谱，并揭示了大肠癌T细胞的亚组分类，组织分布特征，肿瘤异质性和药物靶基因表达。 确定了T细胞群体与分布在组织之间的亚群之间的潜在状态转换关系。 同年，Bian等人。 [21]使用该技术从单细胞分辨率和多组水平分析了人类结直肠癌发生和转移过程中基因组拷贝数变异，DNA甲基化异常和基因表达变化的特征和关系。 以上研究对于揭示人结肠癌的新机制，改善大肠癌的诊断和治疗具有重要意义。
3.1.2 乳腺癌
乳腺癌的起源与转化
乳腺癌是由基因改变的乳腺上皮细胞引起的高度异质性疾病。 Nguyen等。 [22,23,24]通过单细胞测序技术绘制了人类乳腺上皮细胞的单细胞模式，并分析了乳腺癌细胞中细胞类型的多样性和状态。这些发现有助于了解乳腺癌的早期起源，并为改善癌症的早期发现和预防癌症的进展提供基础。 Casasent等。 [6]通过地形单细胞测序报道了乳腺癌的多克隆起源以及原位导管癌和浸润性癌之间的转化机制。这项研究揭示了原位肿瘤亚群和浸润性肿瘤亚群之间的直接基因组谱系。此外，进一步证明了由于将导管内克隆到邻近组织中而导致亚克隆发生的时间和原因以及浸润性癌形成的机理。这项研究的结果为预防早期乳腺癌转变为浸润性癌症提供了理论基础。
乳腺癌微环境
单细胞技术探索了乳腺癌的免疫微环境，并发现了免疫变化。 Azizi等。 [25]在乳腺肿瘤的微环境中绘制了各种免疫细胞的单细胞图。通过该图谱，分析了人类乳腺肿瘤以及配对的正常组织，淋巴结组织和外周血的基因表达特征。发现肿瘤内淋巴细胞和髓样细胞的异质性可通过环境刺激诱导组合基因表达。根据T细胞受体（TCR）和T细胞匹配的单细胞RNA测序数据，T细胞连续激活图谱与癌症巨噬细胞的极化模型不一致。这项研究检查了乳腺癌的微环境，并有助于区分其免疫细胞，并确定浸润肿瘤的免疫细胞的基因表达差异及其原因。
乳腺癌和雌激素
研究人员观察到雌激素与乳腺癌之间有着密切的关系。雌激素激活雌激素受体α（ERα）以驱动乳腺癌的发展。朱等。 [26]通过单细胞转录组测序研究了雌激素信号通路和ERα调控转录的机制，并发现雌激素刺激后ERα阳性乳腺癌细胞的动态转录异质性。这项研究揭示了乳腺癌中与雌激素介导的一氧化碳，嘌呤和多胺合成有关的代谢途径，并发现PPAT和AZIN1是乳腺癌细胞存活和生长的直接ERa目标。它补充了乳腺癌的发病机理，为研究肿瘤靶向药物提供了理论基础。
3.1.3 脑肿瘤
通常认为脑星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤起源于不同类型的细胞。但是，Venteicher等。 [27]发现IDH突变型神经胶质瘤通过单细胞测序技术具有共同的起源。它们之间的差异主要是遗传学和肿瘤微环境组成的差异。肿瘤的两种不同亚型具有普遍相似的干细胞程序，可将其与相似的神经胶质质谱系统区分开。 Tirosh等。 [28]通过人类少突胶质细胞瘤中的单个细胞图谱鉴定了癌症干细胞及其分化后代。这些发现支持了癌症干细胞假说，并证实了癌症干细胞是少突胶质细胞瘤的主要生长来源。这些研究表明这些细胞可能成为新的治疗靶标。 Suvà研究人员建议免疫疗法可用于攻击特定的细胞类型，从而终止肿瘤的生长[27]。这对于治疗此类疾病具有重要意义。
3.1.4 头颈部细胞癌
Puram等。 [29]通过单细胞测序技术分析了头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的生态系统，描绘了头颈部肿瘤的第一个细胞图，并揭示了头颈部肿瘤的类型及其与转移有关的程序。这项研究为肿瘤转移的原因和转移提供了新的认识，并有助于寻找阻断肿瘤转移的新靶点。
3.1.5 血液肿瘤
单细胞测序技术有助于发现分类标记并分析异质性较高的血液肿瘤中疾病发生的原因，为疾病的临床诊断和治疗提供理论依据。
Ledergor等。 [30]在单细胞水平上发现，在不同的骨髓瘤浆细胞样品中，某些基因具有共同的表达和差异。这些共同的表达方式可以寻找新的标记。样品之间基因表达模式和染色体结构的差异可能是骨髓瘤浆细胞高度异质性的原因。这项研究总结了单细胞方法在骨髓瘤的诊断，治疗和预后中的积极作用。外周血用于区分肿瘤细胞和诊断疾病。它不仅可以方便样品的采集，还可以减轻患者采集样品时的痛苦。
在对急性白血病的研究中，Ley等人。 [16]发现了与AML相关的基因，并在每个肿瘤样本细胞中检测到9个突变。结果表明，这些由基因突变引起的异质性可能与发病机制有关。侯等人。 [31]对来自JAK2阴性骨髓增生性肿瘤患者的细胞进行了全外显子组单细胞测序，结果表明该肿瘤代表了单克隆进化。他们进一步确定了与原发性血小板增多症（ET）相关的候选突变，并推测这些突变可能与肿瘤进展有关。 De Bie等。 [32]通过靶向单细胞测序证实了T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）中的突变序列，并且T-ALL的发展可以始于多能祖细胞。
3.1.6 肝癌和肺癌
中国研究人员在单细胞水平上绘制了肝癌微环境的免疫图谱和肺癌的T细胞免疫图谱[33，34]。揭示了肝癌和肺癌免疫细胞的亚组分类，组织分布特征，肿瘤异质性和药物靶基因表达。上述研究有助于了解肝癌和肺癌的免疫微环境，寻找有效的生物标志物，新的肿瘤免疫疗法和药物靶标。对于肝癌和肺癌的诊断和治疗具有重要意义。
尽管世界上有大量的微生物，但研究人员仅研究了一小部分微生物。由于大多数微生物的样本量极小且难以培养，因此研究微生物基因组结构非常困难。然而，单细胞测序的出现导致了微生物学领域的重要突破。单细胞测序技术可提供传统的细菌全基因组研究中所缺乏的特定于细胞的遗传信息。它还发现与细菌生命活动相关的基因，并通过基因组模型对微生物进行分类[35]。 Lan等。 [36]在细菌和真菌的合成群落上进行了高通量单细胞基因组测序（SiC-seq），以分析环境微生物群落中抗生素抗性基因，毒力因子和噬菌体序列的分布。这项研究使原核生物的微生物单细胞测序成为可能。将来，这项技术可能会分离出滴度低的致病细菌样品，并在单细胞水平上对其进行测序，以检查其毒力基因型来源[7]。根据上述研究，单细胞测序技术在微生物的分类，进化和耐药性中起着重要作用。这对于挖掘有意义的环境微生物并找到抵抗抗菌素耐药性的方法非常有用。
3.2 在神经系统中的应用
3.2.1 神经细胞分型
在神经系统中，单个神经元之间存在差异，因为神经细胞中存在一些独特的拷贝数变化[37]。这些神经元之间的异质性使得研究脑回路的形成以及解决神经元重新连接变得困难。但是，单细胞测序技术可以研究神经细胞的许多不同时期，并绘制详细的单细胞图谱，以了解和识别大脑中不同类型的神经元及其连接分子[38]。罗等。 [39]通过高通量单细胞甲基化测序来区分小鼠和人类额叶皮质神经元细胞的亚型。他们在人类额叶皮层中识别出一组新的神经元，并根据神经元的甲基化基团重新定义神经元类型。湖等。 [40]使用一种新的单细胞核测序方法来绘制成人大脑的第二代单细胞图。发现了多种不同的神经元，神经胶质细胞亚型和细胞亚型，它们更容易受到不同脑部疾病的共同危险因素的影响。期望了解神经系统疾病的发病机理。
3.2.2 脑神经发育与再生过程的应用
单细胞测序技术可以研究发育过程中脑细胞的类型以及细胞之间的关系（图2）。范等。 [41]通过单细胞测序技术鉴定了人类中期胚胎多个区域中每个区域的多个细胞亚群，并分析了这些区域中的基因表达和神经元成熟。 Zhong等。 [42]通过单细胞测序绘制了人类前额胚胎发育的单细胞转录组图。通过该图，分析了人类胚胎脑前额叶中细胞类型的多样性以及不同细胞类型之间的发育关系，并进一步揭示了神经元产生和环形成的分子调控机制。研究关键细胞类型的功能并绘制完整的人脑细胞图很重要。卡特等。 [43]在通过单细胞测序绘制的小鼠小脑发育图中，确定了小脑细胞的主要子集和一个有益于小脑发育的亚群。这些研究将促进小脑发育，神经生物学和疾病的未来研究。
3.3 在生殖和胚胎医学领域的应用
单细胞测序技术可以在单细胞水平上对生殖细胞和胚胎细胞的整个基因组进行测序和定量（图2）。这将有助于了解生殖细胞的发生以及生殖和遗传疾病的筛查，诊断和治疗。
3.3.1 生殖细胞 Germ cell
Chen等。 [44]揭示了小鼠精子发生过程中基因表达的动态过程和分子特征，以及通过单细胞测序技术进行选择性剪接的特定模式，以及发现了男性生殖细胞发育特定阶段的关键调控因子。同年，该团队对人正常睾丸细胞和异常睾丸细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。在此基础上，建立了精原细胞亚型，精母细胞亚型和精子细胞亚型的层次模型，并进一步发现了人类生殖细胞的特异性标记。此外，还确定了NOA患者睾丸体细胞表达模式的变化，这可能是NOA的发病机制[45]。上述研究为哺乳动物精子的发育和成熟以及配子的发育提供了有价值的数据来源。它还有助于理解男性不育症和治疗此类疾病。
3.3.2 生殖支持 Reproductive support
单细胞测序技术可以检测少量细胞的优势，可以应用于产前诊断和辅助生殖。通过单细胞测序检测雌性卵细胞的极性细胞或胚胎细胞以选择健康的胚胎移植，可以降低患有先天性遗传疾病的新生儿的出生率，并有助于预防遗传性疾病[46，47]。
3.3.3 胚胎细胞 Embryonic cell
在动物方面，单细胞转录组测序技术用于绘制斑马鱼和非洲蟑螂胚胎的细胞发育图，为理解发育生物学提供重要线索[48,49,50]。 Li等。 [51]通过单细胞多序列测序在植入之前绘制了人类胚胎的全基因组图谱。这项研究对人类胚胎着床前发育中复杂且高度协调的表观遗传过程的分析具有重要意义。 Vento-Tormo等。 [52]通过单细胞测序技术对妊娠早期的胎盘细胞进行转录组分析，并绘制了胎盘细胞图。通过细胞图谱，发现了位于不同蜕膜层和dNK（蜕膜自然杀手）的血管周围和基质细胞的三个亚群。它还确定了调节反应，可将有害母亲的免疫反应降至最低，并揭示有助于胎盘和生殖成功的相互作用。这些发现对于理解早期妊娠过程以及改善妊娠相关疾病的诊断和治疗非常重要。
3.4 免疫学领域的应用
作为人体执行免疫应答和免疫功能的重要系统，免疫系统在抵抗外部病原体入侵方面具有重要作用。许多在免疫系统中具有独特功能的免疫细胞是研究热点。
3.4.1 天然杀伤（NK）细胞，DC细胞和淋巴细胞的应用
单细胞测序技术可以检测单个免疫细胞，从而区分出不同种类的免疫细胞，并发现新的免疫细胞群体及其相互关系（图2）。这有助于了解复杂的免疫系统，并提出新的疾病治疗目标。 Crinier等。 [53]通过单细胞RNA测序鉴定了小鼠和人类中脾脏和血液NK细胞的亚群，揭示了区分血液和脾脏NK细胞的两个不同特征。并通过转录组学的比较，突出了器官和物种中两个主要亚群NK1和NK2之间的相似性。这项研究提供了对NK细胞生物学的深入了解，并有助于将动物研究转化为人类相关研究。维拉尼等。 [54]通过单细胞RNA-seq鉴定了人血中DC细胞和单核细胞的多种亚型，并揭示了具有浆细胞样DCs特性但可有效激活T细胞的DC细胞子集。为了回应这一发现，一位研究人员提出“刺激此类细胞或潜在地增强人体的免疫系统来对抗癌症。”这种细胞可能成为一种新的抗癌手段，可以通过自身的免疫系统清除肿瘤细胞，从而避免了正常化学疗法药物对正常细胞的损害。该研究重新定义了DC细胞之间的关系，有助于分析免疫系统的发育过程和功能，并完成正常和疾病状态下的免疫监视。 Xin等。 [55]使用单细胞RNA测序研究持续感染过程中的免疫细胞和细胞因子。发现在不同感染期间表达IL-10的CD4T细胞的异质性和辅助细胞亚群产生的IL-10在促进体液免疫中起重要作用。
3.4.2 免疫细胞异质性的原因
单细胞测序可以研究由病原体引起的高度异质性的免疫细胞，准确检测单个免疫细胞的遗传物质，并有助于了解人体的复杂免疫机制[56]。有趣的是，除病原体外，衰老还可导致细胞异质性增加。 Martinez-Jimenez等。 [57]在幼鼠和老年小鼠不同状态下对CD4 + T细胞进行单细胞RNA测序，发现衰老会影响细胞的转录动力学，从而导致免疫细胞之间基因表达的异质性增加。此外，免疫细胞不能做出异步反应，并且免疫性能减弱。这项研究有助于解释随着年龄增长免疫系统的减弱。提示细胞间转录变异的增加可能代表了衰老特征，为探索细胞衰老机理奠定了基础。最近，单细胞测序在发炎阶段的中枢神经系统免疫细胞中发现了新发现。 Jordão等。 [58]发现在神经炎性病理学发展中，髓细胞亚群的特异性分化是明显的，因为中枢神经系统巨噬细胞亚群的自我更新，随机增殖和克隆扩增。此外，中枢神经系统巨噬细胞的抗原呈递与神经炎症的病理作用没有显着关系。研究表明，树突状细胞和单核细胞衍生的细胞是实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）期间抗原呈递的主要参与者。这项研究绘制了中枢神经系统中髓样细胞亚群的动态图，揭示了神经炎症过程中髓样细胞亚群的特征分子的复杂变化，并为改善EAE的治疗提供了理论基础。
根据以上研究，免疫细胞的异质性会影响人体的免疫状态。免疫细胞异质性的增加可能导致免疫细胞具有有助于抵抗病原体入侵的特定功能。它还可能导致人体的免疫力下降，这是组织衰老的特征。因此，对免疫细胞异质性的研究可以帮助人们了解机体复杂而微妙的免疫机制，也许可以调整某些免疫机制来治疗某些疾病。
3.5 在消化系统和泌尿系统中的应用
Haber等。 [59]通过单细胞转录组测序发现了许多新的肠上皮细胞亚型，并绘制了肠上皮细胞的表达图。从该图可以解释肠道细胞维持稳态和对病原微生物的反应机制。高等。 [60]使用高精度的单细胞转录组测序来分析人类胚胎期的四个消化器官和成年大肠的多个细胞，揭示了四个人类消化器官发育过程中的基因调控相关机制（图2）。 ）。 Wang等。 [61]证明了在人类胚胎阶段形成初始肾单位的前体细胞的异质性，以及通过单细胞转录组测序将前体细胞分化为肾小管上皮细胞的过程中相应的转录调控事件和信号通路（图2）。 。这项研究还证明了先天性肾病的候选致病基因的表达特征，并有助于先天性肾病的治疗。
四、结论与观点
在完成人类基因组计划后，科学家们提出了一项人类细胞图谱计划，该计划旨在完成人体中37万亿个细胞的作图。单细胞测序技术可以准确地研究单个细胞，并将成为该项目的重要推动力。单细胞测序技术描绘的细胞图可帮助人们区分细胞类型并了解细胞之间的关系。人们可以进一步了解单细胞水平的生理过程和病理机制，以找到新的诊断标记或新的治疗靶标。这将为改善疾病的诊断和治疗提供实践依据。
这篇综述介绍了单细胞测序方法及其在肿瘤，微生物，神经系统，生殖医学和免疫学中的应用，强调了单细胞测序技术在高度异质单细胞研究中的巨大优势。但是，单细胞测序技术仍然存在操作繁琐，检测成本高等问题，限制了技术的推广。希望单细胞测序技术能够更加简化，功能强大，检测成本进一步降低，从而可以应用于基础研究，并在临床诊断和治疗中发挥重要作用。
参考资料
- Cell & Bioscience volume 9, Article number: 53 (2019) 。The single-cell sequencing: new developments and medical applications。 https://cellandbioscience.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13578-019-0314-y
