GATK MarkDuplicates 原理

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1 为什么要进行 MarkDuplicates

重复 reads 被定义为源自单个 DNA 模板的序列。临床应用场景下比如检测肿瘤的突变频率，当测序的reads中 发生/不发生 变异是相互独立的事件时，计算出的突变频率才是准确的。但是PCR过程或者测序仪光学伪影导致的测序reads重复会打破相互独立这个条件，导致后续检测过程不准确。

2 导致 Duplicates 的原因

导致 Duplicates 的原因有两个：1、建库 PCR 步骤导致的 PCR duplicates；2、测序仪的光学传感器错误地将单个扩增的簇检测为多个簇，会导致 Optical duplicates。而且PCR 重复的比例会因测序量的增加而增加，光学重复是随机分布的。

3 怎样确认 Duplicates reads sets

MarkDuplicates 工具的主要原理是比较SAM/BAM 文件中 reads 的 5' 端的序列。Duplicates reads 集都是来自于同一个 DNA 模板，所以我们可以认为这些 reads 在基因组上有相同的5‘端起始位置。此外，BWA 在将 reads 比对到 reference 时，会在末端形成 “clips” ，这会使起始位置的情况发生变化。此外，当reads 比对到负链时，它的起始位置应该在3‘端。因此需要使用SAM 文件中的 flags(正负链) + CIGAR + start_pos 信息共同确认5‘端起始位置。

以下是不同情况下Duplicates sets判定：

（1）r1,r3,r5,r6是一个Duplicates sets，它们比对到了正链，起始位置都是1

（2）r2,r4是一个Duplicates sets，它们比对到了负链，起始位置都是7

（3）r7是一个Duplicates sets，起始位置是3

4 GATK MarkDuplicates 命令

MarkDuplicates 命令有很多参数，主要介绍一下几个参数：

--ASSUME_SORT_ORDER
可以接受 coordinate 排序输入，也可以接受 query 排序输入，但行为略有不同。当输入为 coordinate 排序输入时，比对上的 unmapped mates 不会标记为重复。但是，输入为query 排序输入时，比对上的 unmapped mates 会标记为重复。
--REMOVE_DUPLICATES=true
该参数为 true 时会直接删除duplicates序列，选择reads中碱基质量值加和最大的序列作为代表性序列。
该参数为 false 时会将重复标签加到flags中，其中1024代表重复序列（samtools flags 1024），GATK 后续处理软件会自动识别该参数，将其当做重复reads处理

-M 会输出一个 metrics 文件 用来记录单端和双端 reads 的重复数目
-I 输入BAM文件
-O 输出BAM文件

示例：

# markdup
/bioapp/java8/bin/java -Xmx16g -Djava.io.tmpdir=${outdir}/${sample}_tmp -jar /bioapp/gatk-package-4.0.11.0-local.jar \
                MarkDuplicates \
                --ASSUME_SORT_ORDER=coordinate --REMOVE_DUPLICATES=true \
                -M=${outdir}/${sample}_gatk4.metrics \
                -I=${outdir}/${sample}.sort.bam \
                -O=${outdir}/${sample}_rmdup_realigned_recal.bam

五、 参考资料

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