【2.5.4】临床抗体ADA与非人类灵长动物ADA分析

sam点评：

1. 比较了33个抗体临床ADA数据和试验ADA数据，最后发现两者数据的一致性只有59%。
2. 2017年欧洲药品管理局 发布的“生物药物免疫原性评价的指导意见”，1）其中也提到了动物模型ADA跟人的ADA关联性比较低，不需要提供动物模型ADA的数据；2）但在极少数情况下需要进行毒理学研究或进行药代动力学研究时，仍然可能需要测量ADA以帮助解释研究结果。3）建议可以通过计算的方式预测ADA，以及根据内源性蛋白等经验信息预测ADA，从而减少免疫原性风险。

临床实践中使用的生物药物的免疫原性仍然是药物开发中尚未解决的挑战。非人类灵长类动物（NHPs,Non-human primates ）通常是开发单克隆抗体（mAbs）的唯一相关动物模型，但是由于物种差异，NHP对治疗性mAb的免疫反应不被认为可预测人类的反应。在这项研究中，我们访问了在欧盟注册的所有mAb的药物注册文件，以建立mAb在NHP和人类中的相对免疫原性。

1. 在NHP和患者中，抗药抗体(antidrug-antibodies)形成的发生率仅59％的病例具有可比性。
2. 另外，在59％中，NHP和人类的抗药抗体反应类型不同。
3. 人源化并不一定会降低人类的免疫原性。

当形成清除或中和抗体时，免疫原性会干扰非临床药物开发过程中的安全性评估。虽然对解释研究结果很重要，但免疫原性降低了安全性评估中NHP数据的质量。这些发现证实，比较NHP和人类中mAb相对免疫原性的能力很低。此外，免疫原性限制了信息丰富的NHP研究的价值。

一、前言

大约30年前，重组技术的出现带来了革命性的药物开发新方法，该方法允许在细胞培养物中生产任何基于蛋白质的药物。与传统的小分子药物相比，这些基于蛋白质的生物药物具有重要的优势，例如更长的半衰期和很高的特异性。与被代谢的小分子相反，治疗性蛋白质被降解成其组成氨基酸。结果，大多数不良反应是药物动力学过大的结果。生物药物开发中尚未解决的挑战是，这些蛋白质最终会在某些患者中变成免疫原性，引发免疫反应。试剂的免疫原性取决于特定的特性，例如蛋白质折叠，聚集，翻译后修饰以及B和T细胞表位的存在。此外，制剂中杂质的存在，给药途径，作用方式，患者人群和治疗方案都可能影响免疫原性。在临床实践中，药物诱发的免疫反应可导致许多副作用，例如血清病，超敏反应和注射部位反应，或者在极少数情况下，与内源性蛋白质具有危险的交叉反应性。更常见的是，由于中和或清除了抗药抗体的产生，免疫反应导致药物功效的丧失（ ADAs）.

蛋白质工程改造可能会导致基于蛋白质的药物的免疫原性潜在显着降低。但是，由于几乎没有可靠且可预测的生物信息学方法或用于测量和表征免疫应答的体外筛选，因此难以评估mAb的免疫原性。 。已经开发出可以鉴定免疫原性T细胞表位的生物信息学方法，并建议去除这些T细胞表位以降低免疫原性。Harding等已表明通过人源化这些抗体从嵌合抗体西妥昔单抗（cetuximab ）的V区肽中去除CD4 + T辅助细胞表位会导致免疫原性降低。T细胞激活测定法还可用于测量蛋白药物对引起免疫反应[9,10]，但在非临床安全性评估中，不需要进行这些研究，并且通常使用实验动物来评估免疫原性。但是，在常见的动物模型（例如啮齿动物和狗）中测得的免疫原性的预测价值较低，因为这些模型通常会高估人类的免疫原性。动物的非临床免疫毒性研究也被认为不足以评估与免疫毒性相关的安全性问题，例如过敏反应和自身免疫。动物研究的缺点反映在国际和欧洲免疫原性指南中。尽管不建议在非临床研究中评估免疫原性作为评估人类反应的方法，但动物可能是可用于研究免疫原性的某些方面，例如确定生物仿制药与其参考产品相比的相对免疫原性，并解释动物研究的结果。

除了对动物免疫原性的低预测价值外，一个主要障碍是用于评估治疗性蛋白质免疫原性的测定方法尚未标准化。最近的一项行业调查显示，尽管符合一般准则，但仍在使用几种测定法，这些测定法通常会产生可变的结果，由于不同的测定法形式而无法比较。此外，除其他外，缺乏参考标准使这些测定成为半定量的。这使得直接比较产品和物种之间的免疫原性具有挑战性，即使不是不可能。过去已经评估了mAb在人和动物中的相对免疫原性。在此，我们概述并比较了已批准在2010年之前在欧盟（EU）使用的所有mAb在NHP和人中的免疫原性。我们还研究了免疫原性对解释非临床研究结果的能力的影响。对于本研究，我们可以访问市场许可申请，其中包含为支持欧盟批准的单克隆抗体的市场许可所做的所有动物研究。

二、结果

2.1 NHPs的免疫原性

在我们分析中的33 mAb中（表1），在NHP中评估了27 mAb的安全性。

1. 在NHP中，MAb29和MAb31不具免疫原性，而其余25个MAb（93％）具有免疫原性。
2. 此外，ADA的存在导致了除四个mAb（MAb8，MAb13，MAb14和MAb17）以外的所有mAb的药代动力学或药效动力学特征改变。
3. 对于其余21种产品，免疫原性以不同的幅度和严重性影响药代动力学和药效学（表2）。
4. 五个原发性抗体（MAb7，MAb9，MAb14，MAb15和MAb21）的重复剂量研究受免疫原性限制。

2.2 鼠抗体

在NHP中评估了三种鼠单克隆抗体。 MAb5具有高度的免疫原性，因为在一个月的重复剂量研究结束之前，所有NHP均产生了清除抗体。 MAb7在NHP中具有中等免疫原性，重复剂量研究仅限于两周，因为预计ADA的发展会干扰安全性评估。 MAb8具有免疫原性的潜力仅仅是因为在不断升级的重复剂量研究中，在最后一次给药后检测到ADA，并且仅在一个NHP中对其进行了评估。

2.3 嵌合抗体

在NHP中评估了五种嵌合mAb的安全性。 MAb13具有较低的免疫原性，并且在意外服用MAb13的对照组黑猩猩中测得的低滴度ADA应答。 MAb10和MAb11具有中等免疫原性。 在用MAb11进行的两周重复剂量研究中，一只高ADAs滴度的动物的死亡归因于血小板减少症。 两只具有第二只MAb11剂量的高ADA滴度的动物迅速发展为血小板减少症。 MAb9，MAb12具有高度免疫原性。 由于ADA的发展，MAb9的重复剂量研究被限制在8周内，从而导致快速清除和降低的药效学。 ADA的可观反应使得很难得出有关NHP长期治疗效果的结论性数据。

2.4 人源化抗体

在NHP中评估了这项研究中包括的12种人源化单克隆抗体中的11种。 MAb14，MAb16，MAb17，MAb21和MAb25在NHP中免疫原性低，而MAb20，MAb22，MAb23和MAb24具有中等免疫原性。对于MAb21，有意义的重复剂量研究的持续时间限制为一个月。仅在重复剂量研究中测量了抗MAb24抗体。有趣的是，在抗Mab24抗体呈阳性的NHP中，MAb24的血清浓度升高。此外，某些NHP中的血管周围鞘膜与高抗Mab24抗体滴度有关。 MAb15和MAb18具有高度免疫原性。在大多数NHP中，单次或多次给药后两周内就会形成针对MAb15的抗体，并且清除率提高。当增加剂量时，免疫原性降低。在MAb18的重复剂量研究中，针对MAb18的抗体始终与药物的快速清除相关。仅在首次给药后才能获得可靠的药代动力学参数估计值，因为ADA的发展会干扰其分布和药代动力学。

2.5 人类抗体

NHP没有对MAb29或MAb31产生免疫反应。在NHP中，MAb30的免疫原性差，而MAb26，MAb37，MAb32和MAb33的免疫原性中等。对于MAb30，清除抗体仅在单剂量而不是重复剂量的毒性研究中产生。重复给药后检测到MAb26抗体。在某些情况下，ADAs的存在与血浆清除率增加有关。两种NHP产生了临床溶血性贫血，可能是高抗体滴度继发的。在经过MAb26处理的动物中，ADA的发展可能更为频繁，因为用于确定自身免疫性溶血性贫血的直接Coombs试验表明大多数阳性动物正在缓慢发展为贫血。重复给药后，ADAs的形成会影响MAb33的药代动力学特征，从而导致剂量-反应关系成反比。同样，在接受低剂量的NHP中更频繁地检测到针对MAb32的清除抗体。在那里，ADAs的存在与清除率的提高和半衰期的降低相关，单次低剂量使用后，多达97％的动物体内都产生了抗MAb32抗体。一种人单克隆抗体MAb28在NHP中具有高度免疫原性，并导致结合抗体和中和抗体的形成，因此需要更高剂量来维持暴露。在超过50％的测试动物中形成了针对MAb28的抗体。

2.6 人类和NHPs的免疫原性比较

有关所有mAb的临床免疫原性的数据已包括在SPC（29种产品）或EPAR（4种产品）中。将ADA诱导为20 mAb会影响临床疗效，改变药代动力学特征或引起不良反应。 ADA对9个mAb的存在没有影响，并且4 mAb不会引起ADA的发展（表3）。对于七个mAb，NHP中ADA的发生率高估了人类对ADA的诱导，而对于四个mAb，则相反，预测不足。在NHP和人类中，有16个mAb具有相当的ADA发生率。九种mAb的ADA响应相似，其中包括四种在NHP或人类中均未引起ADA响应的mAb。两个mAb（MAb15和MAb22）在NHP中诱导清除和中和抗体，但仅在人体内中和抗体。在NHP中，ADA更常针对Fc区，导致抗体清除（27例中的17例），而在人类中，ADA最常针对互补决定区（CDR）形成，导致中和抗体（33个案例中的10个）。

三、讨论

最小化免疫原性仍然是单克隆抗体开发中的重大挑战。尽管mAb的人源化已成功降低了某些产品的免疫原性，但尽管进行了此类修饰，仍可发生与临床相关的免疫原性。临床上大多数mAb可以归为可忽略的或可耐受的免疫原性。临床上ADA的发作通常发生在多次注射后，可涵盖数月的治疗。对于医师而言，治疗管理应包括经常监测中和ADA的情况，一旦发生，应停止治疗或患者应改用新疗法。一次性产品（如诊断剂）的免疫原性通常不是问题，但应该考虑的是，当诊断试剂的ADA发展时，它们会对成像（imaging）产生负面影响。仅几次给药后，免疫原性也会导致严重的不良反应。例如，在用该产品治疗的患者中，有1％的患者出现了由对阿昔单抗（abciximab ）的鼠源性CDR区特异的抗体引起的血小板减少症。第二次给患者服用abciximab后，这种作用的发生率可能会增加4倍。

有趣的是，人源化水平似乎并未影响人类ADA的发病率（表4）。这是令人惊讶的，因为人源化的目的是降低免疫原性。以前人们曾质疑过人源化的优缺点。Clark提出的一个有趣的假设表明，人源化创建自体蛋白的基本思想是有缺陷的，因为每个具有独特特异性的B细胞克隆都具有独特的V区序列，并且每个新序列都不可能存在对每个克隆的耐受性。完全相反的免疫学概念是B细胞克隆会激发抗独特型反应，形成调节免疫反应的抗体网络。这些对立面的平衡更能反映实际情况。因此，可变区的免疫原性和人源化不一定相关，降低免疫原性并不是增加序列同源性的简单问题。

在NHP中，嵌合，人源化和人mAb的相对免疫原性似乎也没有什么区别。 。这并不出乎意料，因为由于主要组织相容性复杂类别和T细胞亚群的物种差异，mAb在NHP中很容易被识别为非自身抗体。 NHP中的大多数ADA响应都针对mAb的Fc区（抗同种型），从而提高了清除率。在某些情况下，有报道说诱导ADAs后会丧失疗效和不良反应。相反，在人类中，抗体更常针对CDR（抗独特型），导致抗体功能中和并失去功效。之所以会发生这种情况，是因为CDR是唯一的序列，是人类单抗中最外源的区域，而CDR和Fc区域在NHP中都是外源的。

由于很难直接比较不同物种中不同产品的免疫原性，因此使用它们的相对免疫原性进行种间和产品间的比较。即使具有这种类型的标准化，实验室动物的免疫原性也不能被认为是人类免疫原性的预测。我们的分析证实了这一点，只有59％的测试抗体在NHP和人类中具有相当的免疫原性发生率。尽管在某些情况下ADAs的发生率相当，但NHP中的免疫原性高估了30％的mAb的免疫原性，而低估了11％的mAb在人中的免疫原性。 Bugelski和Treacy根据来源确定了重组治疗性蛋白质的免疫原性类别。原核和哺乳动物蛋白质与人蛋白质的同源性非常低，并且通常具有高度免疫原性。其他类别是新颖的构造(novel constructs)和嵌合，人源化或人抗体。这些蛋白质的同源性很高，尽管免疫原性可能是可变的。甚至NHP研究也缺乏预测免疫原性的能力，并且有过度预测的趋势，尽管人们普遍认为V区具有广泛的同一性（VH框架区氨基酸水平为93％，食蟹猕猴的Vκ为88–99％人抗体序列）。同样，将猕猴的V区与人类的V区进行比较，发现同一性在84％至97％之间。然而，这里的差异被认为可能导致增强的免疫原性反应。

ADA的存在通常会干扰用于检测血清中mAb浓度的分析。因此，应谨慎解释药代动力学或安全性数据。分析设计的改进可以部分克服这些困难；然而，由于缺乏相关的参考标准，分析的正确验证受到了阻碍，并且其他动物物种通常被用作对照，这使得分析的特异性降低。动物也是抗血清的来源，抗血清用于开发和验证用于临床开发的抗体的检测方法。

安全性和剂量确定性研究利用了实验动物，但是免疫原性的潜力使动力学和毒性数据的解释变得复杂，特别是因为ADA的发展可以改变或取消暴露，在某些情况下会导致功效丧失。如果研究组的规模足够大，并且有足够数量的动物没有发育ADA，那么免疫原性就不是问题，但是出于伦理考虑，NHP研究通常将其限于小样本量。这意味着，如果大多数或所有NHP都发展出明显的ADA响应，则很难对安全性研究进行解释。例如，就MAb18而言，大多数NHP在首次给药后会产生清除ADA，这影响了研究结果的可解释性。因此，如果对被测物质有明显的免疫反应，则在非临床药物开发过程中使用NHP的价值将受到限制。超过此点继续进行研究将不会产生相关数据，应重新考虑随后的长期研究

我们的研究有一些局限性。将NHP数据分为三个操作类别是对免疫原性的过度简化。此外，各种研究对ADA发展的速度和效果的报告也有所不同。我们使用Hwang和Foote建立的量表对免疫应答进行分类，并且由于mAb在动物（mAb是外来的）中的免疫原性可能比在人类中更高，因此我们选择将范围提高3倍。这种选择可以被认为是任意的；然而，较高或较低的范围将分别导致对NHPs免疫原性的低估或高估。即使我们的数据集包括到2010年为止在欧盟获得批准的所有mAb，也没有足够的样本进行统计分析。因此，我们只能观察和描述趋势。最后，我们只调查了获得市场授权的单克隆抗体。纳入在药物开发或法规审查过程中失败的mAb可能会提供更大的研究队列，但是尚未公开获得这些mAb的足够免疫原性数据。

总之，这项研究的结果表明，即使使用广泛的免疫原性类别，NHP中的免疫原性反应也无法很好地预测人类的免疫原性。 在NHP中开发出针对测试mAb的清除或中和抗体可能会限制暴露或重复剂量研究的持续时间，进而可能影响药代动力学，药效学和安全性数据的可靠性和可解释性。 最后，由于物种差异和检测技术的局限性，很难比较产品和物种之间的免疫原性。 因此，NHP可能不是适合测试NHP中具有免疫原性的mAb的物种，即使这些是唯一可用的物种。

四、材料和方法

荷兰药品评估委员会访问了欧盟在2010年之前批准的mAb和免疫球蛋白片段的药物注册文件（表1）。非临床总结和概述（包括列表的研究报告）用于评估NHP中mAb的免疫原性。通过评估mAb处理的NHP血清中抗药物抗体的存在来完成此评估。动物研究中免疫原性的报告在市场授权申请中尚未标准化，可能是定量的或定性的。为了规范化数据并实现产品和物种之间的比较，ADA的发生率分为三类，即低，中或高。无论滴度，发生时间和反应持续时间如何，均对ADA的发生率进行评分。当不超过6％的动物对ADAs呈阳性时，该事件的评分为“低”；当不超过6％到45％的动物对ADAs呈阳性时，该事件的评分为“中”；当不超过5％的动物的动物为45％时，该评分为“高”对ADA积极。这些类别是基于Hwang和Foote建立的类别，基于NHPs较高的基线免疫原性，它们是人类同类类别的三倍。三位作者分别对mAb的免疫原性进行了分类。当意见有出入时，对单克隆抗体进行了讨论，以进行最终分配。如果发生药代动力学或药效学特征变化，则记录这些变化的类型和发生率。最后，ADA发生率和药代动力学或药效动力学变化率汇总在一个3x3矩阵中，ADA发生率在行中，药代动力学或药效动力学变化率在列中（表2）。

产品特征摘要（SPC）或欧洲公共评估报告（EPAR）用于确定人类治疗性mAb的免疫原性，定义为3期临床试验中对ADA呈阳性的患者比例。 如果无法检索到这些信息，则使用其他在线资源，例如公司网站或Web数据库。 使用了Hwang和Foote建立的类别：如果在2％或更少的患者中发现免疫原性，则可忽略不计；在2％至15％的发病率之间可耐受，并且如果在超过15％的患者中发生免疫原性，则显着。 注意到由于ADA的发展，SPC或EPAR中提到的功效变化。 如果人类和NHP的免疫原性属于同一手术类别，则认为NHP中的免疫原性是可预测的。 在NHP中评估的单克隆抗体是匿名的。

参考资料

• MAbs. 2013 Sep 1; 5(5): 810–816.Immunogenicity of mAbs in non-human primates during nonclinical safety assessment. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3851233/