【2.5.2】减轻ADA

摘要：对患者进行生物治疗后，抗药物抗体（ADAs）的进展是一个令人头疼的问题，越来越引起制药和生物技术公司的关注。这一严重的临床问题也催生了对新颖方法的创造性研究，以预测，避免甚至在某些情况下逆转这种有害的免疫反应。 CD4 + T细胞是大多数ADA发育中必不可少的参与者，而记忆B细胞和长寿浆细胞会放大并维持这些反应。这篇综述总结了预测和实验确定治疗性蛋白质中T细胞和B细胞表位的方法，特别关注凝血因子VIII（FVIII），其免疫原性在临床上具有重要意义，并且是当前深入研究的主题。描述了在人中对ADA反应表型的方法，包括T细胞刺激试验，以及确定ADAs自身的效价，表位和同型的既定方法和新颖方法。尽管合理的蛋白质工程可以降低许多生物疗法的免疫原性，但是，诱导特异性耐受的互补，新颖方法，尤其是在初始暴露过程中，有望在减少或逆转这些不良免疫反应的未来努力中发挥重要作用。

一、前言

向患者施用生物（例如蛋白质）药物，尤其是连续暴露以治疗慢性病，会引发抗药物抗体（ADAs）的风险[1-3]。如果生物治疗药物是“非自身”物质，则该风险会更高，例如，用于治疗单基因疾病的蛋白替代疗法，例如严重的血友病A [4]或B [5]，庞贝氏病[6]等。但是，即使是构成最大治疗蛋白类别的单克隆抗体，也可以在某些患者中引起ADA [7-9]。例如，用于治疗类风湿性关节炎的抗肿瘤坏死因子（TNF）α抗体的免疫原性以及为减轻炎症性肠病（IBD）症状而开出的生物治疗药物的免疫原性是一个重大问题，临床上的炎症环境更加恶化需要治疗的疾病[10-12]。从对西妥昔单抗上半乳糖-α-1,3-半乳糖部分的免疫反应中可以看出，IgE抗体的发展会引起严重的超敏反应，通过使用未执行此翻译后修饰的中国仓鼠卵巢（CHO）表达系统，该问题得以缓解[13]。

中和的ADA抵消了生物治疗剂的临床益处，而非中和的抗体也可能降低功效，例如，通过影响清除率，药代动力学和药代动力学。对治疗性蛋白质的免疫反应，这些治疗性蛋白质是与内源蛋白质“生物类似物”，甚至与内源蛋白质具有相同的氨基酸序列， 可能激发结合内源性和治疗性蛋白质的抗体； 如果内源蛋白发挥基本功能，那么这种脱靶效应可能是严重的，甚至是致命的。

举一个最近的例子，重组激活因子VII（rFVIIa）是一种内源性丝氨酸蛋白酶，可启动外源性凝血级联反应，并且是替代A或B血友病患者的替代“旁路”疗法，这些患者对置换无反应疗法（通常是由于分别针对输注因子VIII（FVIII）或因子IX（FIX）的ADA的发展）。它也已被广泛地用于治疗创伤后出血性出血的标签外。开发了合理设计的rFVIIa类似物，与野生型序列相比，该酶仅具有三个氨基酸取代（与野生型序列相比具有更高的酶促活性），并测试了在血友病A和B患者中的功效。尽管“改良的” rFVIIa与野生型（内源性）FVIIa具有99％的序列同一性，但参加III期临床试验的72名患者中有8名开发了针对生物治疗的抗体，其中四项多克隆反应显示出与fVIIa的交叉反应性野生型FVIIa蛋白[14]。由于野生型蛋白已经在临床上使用了20多年，而没有ADA应答的报道[15-17]，所以这种强免疫原性没有被预料到。幸运的是，在滴度增加以显着影响止血之前，已检测到抗体并中止了试验。在另一项试验中测试了另一种经序列修饰的rFVIIa变体，并评估了一名患有ADAs的患者的免疫反应。有趣的是，随后的表位作图表明该受试者的PBMC对具有野生型FVIIa序列的合成肽有反应，但对与修饰的氨基酸序列相对应的肽没有反应[18]。某些内源性蛋白质的治疗性给药，例如促红细胞生成素（Epo）[19,20]和干扰素-β[21,22]，已显示出激起了不良，罕见但潜在的严重免疫原性。在某些情况下，抗Epo抗体可能引起抗体介导的红细胞发育不良[23,24]。开发更有效的方法来预测和降低产品开发过程中的蛋白质免疫原性，而不是在昂贵的临床试验过程中遇到免疫反应，是改善生物治疗剂有效性和安全性的迫切优先事项。

这篇综述将首先简要概述ADA发展的病因，包括T细胞和B细胞对外源抗原的反应的作用，以及在某些情况下ADA在天然受试者中的存在。然后将描述用于预测和确认T细胞和B细胞表位的计算机方法和实验方法，以及通过合理的氨基酸取代和/或将表位掩盖部分与生物治疗剂连接来“脱免疫”蛋白质的方法。总结了一些成功应用此类技术明显降低了蛋白质免疫原性的案例，并附有警告。分析ADA本身的分析方法包括表位作图和总特异性抗体效价和同种型/亚类的定量。解决对剩余的降低其免疫原性的挑战，而不是调动对蛋白质药物翻译潜力的热情，将需要创新的方法，这些方法肯定会增进我们对人类免疫学的理解，尤其是可以实现对特定抗原的免疫耐受的机制或恢复。

二、大多数ADA需要CD4 + T效果器帮助

多次暴露于外源抗原，尤其是在炎症或先天性免疫信号传导（“危险”）的情况下，可以引发和增强宿主免疫反应，从而产生高亲和力，高滴度，类别转换的抗体。但是，这种基本的防御机制在响应旨在治疗临床疾病的生物疗法而被激活时，是一种有害的甚至是不良事件。 如果生物治疗药物是自身蛋白的序列修饰版本，情况就更加复杂了，包括治疗性单克隆抗体在内的一大类，如记忆效应子以及调节性T细胞和B细胞可能被刺激和/或表现出可塑性， 这将受到发生抗原提呈的当地环境的深深影响 。因此，即使在相同的治疗性蛋白质中具有相似的HLA限制的抗原决定簇识别的患者，其免疫结果（抗药物抗体，CD8 + T效应反应或耐受性）也可能显着不同。

生物治疗药物构成了制药公司投资组合中一个庞大且不断增长的部分，其早期发展还受到政府和私人基金会的大量投资的推动。在过去约20年中，随着越来越多的生物药物通过临床前测试进入临床试验，人们逐渐认识到，应将免疫原性视为一种预期的结果，而不是可能的并发症，并且应在从从实验室到临床（translation from bench to bedside）翻译的早期就对潜在的免疫原性进行测试和解决。

施用后，治疗性蛋白质，无论是内源性蛋白质还是“非自身”蛋白质，均可被抗原呈递细胞（APC）内吞，然后在免疫蛋白酶体中将其加工成其组成肽。然后可以将这些肽的一个子集呈现在个人的主要组织相容性复合体（MHC）上，仅限于其HLA I类和/或II类等位基因[25,26]。重要的是，这种最初的表现可能导致耐受性或T效应反应，从而为生发中心(germinal centers )的B细胞和/或激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL）提供帮助。在这里，我们将重点放在CD4 + T细胞在T效应抗体帮助与耐受之间的作用上，但是CTL反应是一个相关的潜在问题，在药物设计过程的早期也应予以考虑。

树突状细胞（DC）是专业的APC，其在放大抗原特异性免疫反应中的作用已被人们认可了数十年[27,28]。除了识别和加工特定抗原外，它们还可以通过表面上的toll样受体来检测与损伤或病原体相关的分子模式分子，从而激活先天性免疫途径[29]。 DC通过先天上调MHC II类（MHCII）和CD80表面表达来协调先天性和适应性免疫，从而降低了可以识别MHCII上存在的特定肽的幼稚T细胞活化的阈值（信号1）。 T细胞上CD80 / 86与CD28的结合会产生共刺激信号（信号2）。炎性细胞因子对T细胞的进一步刺激产生信号3，促进T效应子的增殖以及细胞因子和趋化因子的分泌，特别是在生发中心，在那里B细胞随后被激活并继续分化为分泌抗体的浆细胞和记忆B细胞。

三、耐受性DC呈递可能预防ADAs

在没有共同刺激的情况下，T细胞可能会变得无反应。不成熟的致耐受性DC（iDC）是一个独特的DC子集，可以有效地呈递肽，而又不会促进天然T细胞的强烈共刺激。 iDC分泌低水平的白介素（IL）-12和较高水平的IL-10和TGF-β，并被认为通过无反应和T效应子的缺失，以及抗原特异性CD4 + CD25+ FoxP3 + T调节细胞（Tregs）[30]的克隆刺激而有助于耐受。 。 IDC通过外周和淋巴迁移，在其中它们通过抑制自身反应性T效应子在维持对自身抗原的耐受性中起重要作用。它们的迁移性质和抗原特异性耐受性的提高表明，在初次接触生物治疗药物期间避免“危险”信号可能会使临床医生抓住iDC的潜力，以促进外周药物特异性耐受性。有趣的是，iDC吞噬凋亡细胞后，而非坏死细胞被吞噬，从而增强了对自身抗原的持久耐受性，从而保持了对细胞内抗原的耐受性，该抗原在正常细胞更新期间暴露于免疫系统而没有危险信号[31]。 。正在探索利用T细胞凋亡减少同种异体移植排斥的细胞疗法的潜力[31]，单核细胞衍生DC的离体倾斜成耐受性表型[32]为基于iDC的疗法带来了希望。

与伴随器官移植或自身免疫的免疫挑战相比，特定生物治疗药物（例如重组蛋白）的抗原结构要复杂得多。 因此，可以考虑在致耐受性iDC上呈递生物治疗衍生肽的其他，替代或补充方法，包括操纵抗原本身以减少APC表面上的肽MHCII呈递。 这种蛋白质工程有效降低免疫原性/抗原性应是可行的，因为参与激发同种免疫反应的免疫显性表位少得多。 实际上，在新型生物治疗药物的设计中，对CD4 + T细胞表位的预测，实验验证和改变已越来越多地纳入工作流程中[3]。

四、鉴定和修饰生物治疗学中HLA限制的T细胞表位

如果肽表位不再存在于个体的MHCII中，则成功识别和清除免疫显性CD4 + T细胞表位可通过免疫学无知明显降低ADA的发生率和严重性。 或者，降低的MHCII亲和力可以降低有效的MHCII-肽-TCR突触形成的可能性，从而导致T效应子的活化，增殖和信号传导，并且还可以促进Treg而不是T效应子的扩展。 此外，通过重组蛋白序列修饰的表位“去免疫”是降低其免疫原性的一种有吸引力的方法，因为它发生在生物治疗药物本身的设计阶段，而不是随后在给药患者期间或之后通过临床干预。

在2005年，Sette及其同事假设蛋白质药物的免疫原性是由于T细胞对有限数量的免疫性T细胞表位的反应所致，这些表位通常混杂地与多个HLA等位基因结合[33]。对这一假设进行了系统的测试，以验证在临床测试后显示出免疫原性的五种治疗性蛋白质。所采用的方法包括计算机模拟HLA结合序列和体外实验，测试合成的，重叠的肽对重组HLA-DR分子的结合亲和力。还使用来自七个HLA型供体的PBMC的ELISPOT分析评估了跨越促红细胞生成素（Epo）氨基酸序列的多肽的免疫原性。这些供体PBMC样品中有5个响应Epo肽分泌了IL-2，而两个免疫原性“热点”（残基91-120和126-155）引起了最频繁的响应。有趣的是，也已经证明了针对其他自身蛋白的类似的离体免疫原性[1,34–36]，特别是如果使用超生理浓度的蛋白或肽抗原刺激用抗原培养的PBMC或CD4 + T细胞级分呈递细胞，说明以下事实：一些自身反应性，较低存活率的T细胞逃避了胸腺的缺失，并为将来的自身免疫带来了潜在的风险。最后，对相应的HLA-DR预测占据锚位置P1的Epo残基的序列修饰具有降低结合亲和力和免疫原性的预期效果[33]。总体上的“取消免疫”策略已得到进一步完善，现在可在免疫表位数据库网站上获得[37]。在公共和私营部门，还开发了其他计算机模拟算法来预测MHCII结合和T细胞表位[38-42]，包括可能对Tregs和T效应子产生不同影响的表位，称为“ Tregitopes” [43,44]和结合蛋白质结构信息来预测氨基酸取代对稳定性的影响的算法[41,45,46]。在用蛋白和/或合并的或单个的肽刺激后，类似的T细胞增殖测定法和细胞因子分泌测定法，例如ELISPOT，被广泛用于在疫苗以及生物治疗学中绘制临床上相关的T细胞表位。已经使用体外试验评估了治疗性单克隆抗体免疫原性的风险，该试验利用了来自天然，健康人类供体的PBMC在生物治疗剂刺激后检测T细胞增殖，细胞因子分泌等。这样的测定也可用于评估生物治疗剂中影响免疫原性的批间变异，例如聚集，污染，糖基化或翻译后修饰[47,48]。

中和的ADAs在血友病A（HA）中是一个特别严重的问题，这是由于缺乏循环凝血蛋白VIII因子（FVIII）而导致的X连锁出血性疾病。 多达三分之二的严重HA患者会形成中和ADA，血液学家将其称为“抑制剂”，甚至因错义突变而导致轻度或中度HA的患者也可能会产生抑制剂[49]。 在后一种情况下，通过分离对错义位点处具有野生型序列的肽作出反应的T细胞克隆，已在多个受试者中最终确定了与错义替换位点相对应的CD4 + T细胞表位[50-54]。 FVIII表位也已在动物模型研究中被鉴定和修饰[55-57]。 重度HA受试者中促成ADA的表位数量是当前研究的主题，并且与蛋白质“去免疫”策略有关。

临床相关的HLA限制性T细胞表位的定位得益于实验方法和计算机方法的组合，例如上述方法。例如，可以从HLA型供体扩增单核细胞来源的树突状细胞（mo-DCs），用生物治疗药脉冲，使用合适的抗体拉下HLA-肽复合物，然后洗脱并通过质谱鉴定肽。 Voorberg实验室已证明，提出的FVIII肽仅包含可能与特定HLA-DR，DP和DQ结合的那些肽的一个子集（如预测算法和直接的蛋白-肽结合实验所表明的[58-60]）。相似的方法已经用于定位血液蛋白ADAMTS13中的自身免疫表位[61]。然后可以使用计算机算法来预测这些所呈递的肽内的MHC结合寄存器。也可以使用基于结合和计算机模拟实验设计的合成肽来进行T细胞增殖或ELISPOT分析或MHC四聚体染色，以鉴定临床上相关的表位。重要的是，可以使用健康对照的血液样本以及重组HLA蛋白和合成肽来确定特定HLA上的肽段， 允许以后对珍贵的患者样品进行更高效的T细胞刺激实验（需要更少的肽和更少的血液）。

我们的实验室利用载有FVIII肽的MHCII四聚体来查询具有F8基因缺失突变和持续性高滴度抑制剂的严重HA患者的T细胞反应[62]。当应用于FVIII蛋白时，系统的四聚体引导的抗原决定簇定位是一个艰巨的问题，因为它的大小很大（2332个氨基酸残基），因此需要大量的血液来测试跨越整个序列的重叠肽段。在这种情况下，应捐赠足够的血液，以绘制已知的免疫原性FVIII A2，C1和C2结构域。有趣的是，通过四聚体仅鉴定了一个表位，并且对该表位特异的克隆和多克隆系的T细胞受体（TCR）β可变测序表明TCR库是高度寡克隆的。尽管未经测试的FVIII结构域中的其他表位，以及四聚体无法识别的较低亲和力的表位也可能对这种免疫反应有所贡献，但这些结果为蛋白质工程尝试提供了鼓励，甚至可以降低大型蛋白质（例如FVIII）的免疫原性。实际上，在MHCII锚点P1和P4的FVIII表位中进行战略性氨基酸取代，可以在不影响蛋白质比活性的情况下废除患者来源的克隆和品系的增殖[63]。在该受试者中观察到的狭窄抗原决定簇和TCR库表明，克隆缺失和无反应性有助于外周耐受，尽管即使一些成功耐受的患者继续循环使用FVIII特异性T-效应物[64]，其耐受性也可能是由于Treg抑制免疫反应[51]。尽管尚未在临床中进行测试，但我们假设通过FVIII蛋白工程去除免疫显性CD4 + T细胞表位可以减少未用过HA的患者的抑制剂发生率，并且还可以提高多次输注抑制剂形成后诱导耐受的临床方案的成功率耐心。

表位去免疫策略已显示出降低其他经序列修饰的蛋白质的免疫原性的潜力，这些蛋白质包括用于癌症治疗的重组免疫毒素[65-72]，干扰素-β[73]，干扰素-α[72]，葡萄球激酶[74]， β-内酰胺酶[75]，Epo [33,37]和单克隆抗体[37,76]。 诚然，一些免疫显性表位将对应于不影响生物治疗功能而不能改变的序列，表位作图的主要影响最终可能是促进耐受患者对特定抗原的新颖方法[77-79]。 允许患者耐受特定抗原的蛋白质“去免疫”策略和疗法是高度互补的方法，如果一起使用，应协同作用以改善患者的预后。 蛋白质工程和过程控制的改进以降低聚集倾向也可以降低潜在的免疫原性[80]。

五、在生物治疗学中鉴定和修饰B细胞表位

B细胞表位既是抗体结合表面，又是界面，在回忆反应过程（recall responses）中，记忆B细胞通过这些界面被激活。此外，脾边缘B区细胞和巨噬细胞可作为前哨使者，在给药后不久即可遇到生物治疗，将它们转运（在某些情况下）至生发中心，在此生发中心会引发幼稚的免疫反应[81-84]。产生对刺激性抗原具有增加的亲和力的B细胞[85]。因此，B细胞表位修饰的目标包括产生一种生物治疗剂，该生物治疗剂可以通过预先存在的抗体逃避中和和/或减少或消除通过B细胞受体的信号传导。

通过确定抗原-抗体复合物的晶体结构，并通过氢-氘（H / D）交换/质谱分析，可以以高分辨率定位B细胞表位，以鉴定受溶剂保护的抗原-抗体界面[86,87] ，因此来自H / D交换。 可通过竞争ELISA分析来分析血浆或血清中的单克隆抗体或多克隆抗体，从而获得较低分辨率的表位作图

对于抗FVIII ADA，早就知道猪FVIII可以恢复止血作用 在许多HA抑制剂患者中，尽管这些患者中的一部分最终会产生中和猪以及人FVIII的抗体[92,93]。基于这一观察结果，一些实验室正在研究人FVIII中B细胞表位的合理修饰，包括生成人猪FVIII杂合蛋白[94,95]。我们的实验室通过首先精细映射被中和针对其C端C2域的抗体识别的表位来研究FVIII的B细胞表位工程[96,97]，这是中和抗FVIII ADA的常见目标[98,99]。首先，产生了60个重组（r）FVIII-C2结构域蛋白，每个蛋白都有一个暴露于丙氨酸的单表面暴露侧链。然后通过表面等离振子共振（SPR）评估这些突变蛋白与一组中和性抗FVIII MAb的结合[88]，以测量这些单氨基酸变化对亲和力的影响[96,97]。这些实验确定了包含每个“最小表位”的少量残基，定义为对抗体亲和力贡献最大的残基（图1）。

1995年，Clackson和Wells在较大的蛋白质-蛋白质结合界面中描述了“热点”，这是造成大多数结合亲和力的原因[101]。在B细胞表位作图和“去免疫”策略中使用此概念很有吸引力，因为它限制了生成较少抗原性rFVIII蛋白所需的氨基酸取代总数，从而降低了无意引入新表位的可能性。 SPR识别的表位与共结晶和其他方法相一致，以表征其中的几种抗原-抗体复合物[86,102–104]，从而进一步验证了该方法。

在其他应用中，Pastan实验室通过序列修饰修饰了重组免疫毒素的B细胞表位，证明当针对来自针对原始生物疗法开发ADA的受试者的血清进行测试时，其抗原性降低了[105-107]。 B细胞表位的去除在增强对自身抗原如烟碱乙酰胆碱受体的耐受性方面也显示出希望[108]。最后，如果抗独特型抗体中和治疗性单克隆抗体的活性，则可能会出现问题，但相反，在某些情况下，可能会故意开发抗独特型，例如通过噬菌体展示，并将其用于中和患者产生的多克隆抗体对抗治疗性蛋白质[109]。

具有临床意义的抗FVIII ADA可以进行类别转换，主要由IgG1和IgG4组成，并且已提出检测IgG4和/或具有更高亲和力的FVIII特异性抗体可作为正在发展的抑制剂反应的预测生物标志物[110-112] ]。 鉴定较早的预后生物标志物，例如特定的细胞因子，内体或细胞特征，仍是尚未实现的目标，也是当前研究工作的主题。 这样的早期检测可以改善患者的预后，因为临床免疫耐受诱导方案启动时具有较高的成功率，而抗体滴度仍然相对较低。

夹心ELISA分析和竞争性ELISA已用于定义HA抑制剂患者样品中抗FVIII抗体的同种型，亚类和表观/相对亲和力[110]。已通过ELISA使用同种型特异性Abs以及由融合有恒定CH1-CH2的FVIII特异性scFv可变重链结构域组成的工程Abs进行了ELISA半定量分析了患者样品中FVIII特异性免疫球蛋白同种型的比例。 IgG1，IgG2，IgG3和IgG4的CH3片段作为内部对照[113]。作为一种替代方法，Lewis等开发了一种新的基于SPR的检测方法，以定量抗FVIII抗体的总效价以及包含该总抗FVIII抗体的每个亚类的量[114]，利用了抗体饱和结合后响应单位（RU）的变化这一事实。固定在生物传感器芯片上的配体很容易转化为捕获抗体的总质量（图2）[115]。单克隆或多克隆IgG的分子量约为150 kDa。因此，可以估计被固定抗原如FVIII捕获的IgG分子的数量。类似地，在随后注射抗-IgG1，抗-IgG2，抗-IgG3和抗-IgG4抗体之后，RU增加可以转化为固定的这些分子的数目，从而得到每种抗体同种型的总量和相对比例。该测定法可用于将纯化的多克隆抗体或血浆/血清样品（用辛酸预处理以减少非特异性结合）表征到可接受的水平。它可以轻松地适应针对其他生物治疗药物的表型抗体。

异源或自身抗原上的线性B细胞表位可以通过在包含对应于目标蛋白抗原的固定肽的微阵列孔中孵育血浆或血清样品来鉴定[117]。通常，具有跨生物治疗性蛋白质序列的重叠序列的15至20聚体合成肽通过柔性接头避免空间干扰而共价连接至固体表面，例如衍生化的载玻片。尽管有一些警告，包括肽不能概括由蛋白质氨基酸序列的非连续区段组成的构象表位；亲和力低于蛋白质结合相互作用；以及假阴性和假阳性，此类微阵列可产生有关临床相关免疫反应的有价值的信息。实际上，一些反应性肽对应于蛋白质Y表面上的“环”，从而正确地识别出至少一部分相应的B细胞表位。横截面临床样品的测定可以鉴定与疾病状态相关的模式，并且来自同一受试者的纵向样品可以说明在治疗过程中例如抗体检测后的免疫治疗过程中的表位漂移。事实证明，这种阵列分析在疫苗研究[118,119]和自身免疫性疾病，感染和癌症的概况分析[117]中很有价值，它们也可用于表征ADAs [120]。最近的一些有希望的发展包括将肽阵列数据与噬菌体展示结果，蛋白质结构信息，B细胞表位预测算法等相结合[121]。由固定蛋白（例如自身抗原或同种抗原）组成的微阵列的使用是一种新兴的蛋白质组学方法，用于表征病理学抗体，潜在地产生表征构象表位的信息，该信息与肽微阵列可实现的表位的精细定位互补[122S124]。在临床样品的测定中使用蛋白质代替肽作为捕获分子存在相关挑战，例如，涉及蛋白质稳定性，使用微阵列孔中发现的蛋白质进行测定的灵敏度和可重复性等，但是持续的技术进步表明，这种蛋白质组学分析在临床诊断和表位作图应用中将越来越重要[125]。

噬菌体展示技术可用于检测ADA并绘制ADA，Abs等识别的线性或构象表位[126,127]。在疫苗[128S131]过敏[121,127,132]和自身免疫[133]的研究中，使用噬菌体展示文库表征免疫应答非常类似于对生物疗法的同种免疫应答的分析。噬菌体展示方法正在不断发展和完善，特别是通过结合其他技术（包括生物信息学和结构分析以进行质量控制）[121,127,134S136]，并识别蛋白质抗原上表面暴露侧链的簇，从而概括了噬菌体展示的模式/特性蛋白（例如scFvs）或肽[133]。预测蛋白质抗原上的B细胞表位比预测T细胞表位更具挑战性（没有明显的过度预测），因为B细胞表位通常是构象的，即由非连续而不是线性的氨基酸组成氨基酸序列和抗原的三维结构通常是未知的。例如，最近在重组精氨酸脱亚氨酶（一种癌症生物治疗药物）中的应用，正在投入大量的创造性工作来确定和修饰B细胞表位以降低抗原性的计算方法。与基于氨基酸序列形成β转角倾向的从头算方法或基于机器学习的算法相比，将某些实验数据（例如肽阵列或噬菌体展示结果）纳入表位识别方法可大大提高成功率。[42] 。当考虑B细胞表位修饰以减少抗原性时，因此，在可能的情况下，优选对B细胞表位进行可靠的实验确定。

六、免疫原性和患者结果的预测

除了表征ADA本身之外，对患者血浆样品的免疫谱分析还表明，初次HA受试者，年龄匹配的健康对照[138]和有和没有中和ADA反应的HA受试者之间循环细胞因子和微粒类型的差异[ 139S143]。但是，由于研究主要是横断面的，因此这些差异均未纳入一般临床实践或显示为可预测的。同样，已经指出了需要使用针对所有生物制剂的ADAs预测生物标志物进行标准化测定的方法，以改善临床决策[144]。凭直觉，人们希望与自身免疫性疾病相比，在针对单基因疾病（如血友病）的治疗性Abs或蛋白质替代疗法的同种免疫反应中，此类生物标记物可能会早发现，因为其抗原及其抗原的剂量和时间表管理是众所周知的。从患者和相关动物模型中收集样本的纵向研究对于分析针对生物治疗的初次免疫反应以及随后的日趋成熟的免疫反应至关重要，从而导致临床上显着的ADA与无反应。可靠的预测性生物标志物的鉴定将提供合理的，基于证据的标准，以决定哪些患者在生物治疗期间可能会受益于瞬时免疫抑制疗法（并接受相关的风险）。

七、总结

这篇非全面性的综述着重介绍了几种当前的方法，困境和新颖的技术，以剖析ADA反应并减轻其对有前途的生物治疗学翻译的影响。在这里，我主要研究从患者和正常健康对照中获得的临床样品，而不是动物模型研究，部分原因是动物测试通常无法预测人的免疫原性。特别是，通过计算机预测和直接测定从血样中分离出的细胞级分的方法，可以最好地评估工程治疗蛋白的影响（例如，改变其氨基酸序列以修饰特定特性）。但是，即使进行了广泛的测试，也无法在进行临床试验之前检测到免疫原性。动物模型，包括具有人源化免疫系统的小鼠，对于机制研究（包括测试诱导对生物治疗剂的耐受性的新方法）的机制研究非常重要。与免疫原性和耐受性研究相关的一个中心问题是，为什么大多数接触生物治疗药物（例如FVIII）的患者实际上会产生外周耐受，而其他患者则发展出可能无法使用免疫原性药物进行进一步治疗的ADA。已经进行了巨大的努力来对几种治疗性蛋白质进行[去免疫]，并在细胞和抗体水平上表征ADA应答。蛋白质工程策略和诱导耐受的临床方案是改善患者预后的补充方法。初生患者在初次接触生物治疗药物期间的前瞻性研究可以提供特别重要的机制信息。特别是在罕见疾病（例如血友病A和B）的情况下，患者人数和可用样本有限。因此，进行药物治疗或政府资助的生物治疗临床试验的研究人员与从事基础科学研究的基础科学家之间的创造性合作关系，有望鉴定出免疫原性的预测性生物标志物，并提出未来的新型潜在致耐受性疗法。

参考资料

• Anti-Drug Antibodies: Emerging Approaches to Predict, Reduce or Reverse Biotherapeutic Immunogenicity. Antibodies 2018, 7, 19; doi:10.3390/antib7020019