【2.4.4.4】AliCE
AliCE的全称为Antibody-Like Cell Engager。该双特异抗体的设计是以抗体的VH和VL形成的异源二聚体为基础。分别在VH和VL上连接Fab,形成新颖的2+1型双特异抗体（图4）。该抗体由韩国Y-BIOLOGICS公司和先进科技学院（KAIST）联合开发。
图4：AliCE双特异抗体结构示意图
AliCE双特异抗体由3条链共表达：ACE-HC-VL，ACE-HC-VL和ACE-LC。抗体的纯化利用CaptureSelectCH1-XL亲和层析柱纯化。SDS-PAGE结果证明，AliCE双抗在没有ACE-HC-VH链存在的情况下仅含有微量错配（图5C，第5泳道）。还原和非还原CE，质谱结果证明纯化后的抗体三条链的比为1：1：2没有存在错配（图5,D,E,F）。
图5：AliCE双抗设计表达及纯度和错配验证
稳定性方面，AliCE双抗体（ACE-05）的溶解温度在67°要高于BiTE的62°。并且抗体在室温下，不同PH溶剂中还保持很高的稳定性。
图6：AliCE双抗体稳定性
Ontarget 和Off target ：体外细胞实验结果证明AliCE双抗ACE-05可以更好的结合PD-L1阳性的细胞，明显高于BiTE-05和ACE-31，而在结合PD-L1阴性细胞方面，ACE-05明显低于BiTE-05和ACE-31（图7A），这证明ACE-05双抗有较高的特异性。而且体外杀伤实验证明ACE-05有更好的疗效（图7D/E）。
图7：AliCE双抗On target 和Off target 验证
半衰期及体内药效 ： 在动物实验上，ACE-05双特异抗体在抑制肿瘤生长方面要优于BiTE-05，并且小鼠体重变化明显小于BITE-05，这说明ACE-05双特异抗体不仅药效好而且有较小的副作用。 在半衰期方面，ACE-05在大鼠和猴子体内的半衰期分别为12.5h和31h，优于BITE的4.64h和9h。
图8：体内药效及半衰期
总结
AliCE为2+1形式的双特异抗体，与非对称IgG型双特异抗体相比，生产更加简单，一步亲和层析纯化后可以到达较高的纯度，在错配方面几乎观察不到错配分子。在稳定性方面，该双抗与IgG抗体类似，有较高的稳定性；关于亲和力和药效，该双抗因为可以包含两个肿瘤相关结合位点，因此比BiTE有更好的治疗效果；在Off target效应上，因为与CD3的结合结合能力较弱，因此副作用更小。依据该平台，Y-BIOLOGICS已经有两个项目正在开发中。
参考资料
- https://www.cn-healthcare.com/articlewm/20210402/content-1206128.html
- Shanshan Lang, Su Yang, Scott Bidlingmaier et al.LegoBody: facile generation of bispecific and multi-specific antibodies. 2019
- Seil Jang, Jaeho Song, NaYoung Kim et al. Developmentof an antibody-like T-cell engager based on VH-VL heterodimer formation and itsapplication in cancer therapy.Biomaterials2021
- G.Wozniak-Knopp, S.Bartl, A.Bauer et al. Introducingantigen-binding sites in structural loops of immunoglobulin constant domains: Fc fragments with engineered HER2/neu-binding sites and antibody properties. Protein Engineering 2010
- Elisabeth Lobner, Anne-Sophie Humm, Georg Mlynek et al. Two-facedFcab prevents polymerization with VEGF and reveals thermodynamics and the 2.15 Åcrystal structure of the complex. mAbs 2017
- F-star 官网 https://www.f-star.com/
