【5.1】实验--抗原抗体反应
一、原理
1.1 抗原抗体反应
抗原与相应抗体的特异性结合反应称为抗原抗体反应。抗原抗体反应既可在 体内作为体液免疫应答的效应机制自然发生，也可在体外作为免疫学实验的结果 出现。在体内，可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，有时亦可引起 免疫病理损伤;在体外，根据相应抗原物理性状(颗粒状或可溶性)以及反应的条 件(电解质、补体等)不同，可出现凝集、沉淀、细胞溶解和补体结合等反应。
1.2 抗原抗体反应的特点
- 特异性 ：一种抗原分子通常只能与其刺激机体后产生的抗体结合，这种特 异性的物质基础是抗原分子的表位和抗体分子高变区。
- 比例性 ：是指抗原与抗体发生可见反应需要遵循一定的量比关系。
- 可逆性 ：抗原与抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离的抗 原和抗体。
- 阶段性 ：抗原抗体反应可分为两个阶段:(1)结合阶段:抗原与抗体发 生特异性结合，时间较快，一般肉眼不可见;(2)反应阶段:在电解质、温 度、PH 等适宜条件存在下，形成肉眼可见免疫复合物的反应阶段，时间较长。
1.3 影响抗原抗体反应的因素
影响抗原抗体反应的因素较多，主要有两方面:一方面是受到抗原、抗体的 自 身因素的影响;另一方面是受到电解质、酸碱度、温度及时间等实验环境因素 的 影响。
1.电解质
抗原抗体结合后由亲水性变为疏水性，此时易受电解质影响，如 有适当浓度电解质存在，就会使抗原抗体失去一部分电荷而相互凝集或沉淀，出 现可见反应;若无电解质存在，则不出现可见反应。通常在血清学试验中，以 8.5g/L NaCl 溶液作为抗原抗体的稀释液及反应液，其中 Na+和 Cl-可分别中和胶 体颗粒上的电荷，使胶体颗粒的电势下降，形成可见的沉淀物或凝集物。但如果 电解质浓度过高，则会出现非特异性蛋白质沉淀，即盐析。补体参与的溶细胞反 应，除需要等渗的 NaCl 溶液外，还需适量的 Mg2+和 Ca2+离子参与。
2.温度
抗原抗体反应一般在 15~40°C范围内均可进行，最适温度为 37°C。 在此范围内温度越高，分子运动速度加快，增加抗原抗体接触机会，反 应速度越 快，但亦容易引起复合物解离;温度越低，反应速度缓慢，但抗原抗体 结合牢固，易于观察。某些特殊的抗原抗体反应需要特定的温度，如冷凝集素在 4°C时与红细胞结合，20°C以上反而解离。
3.酸碱度
合适的 pH 是抗原抗体反应的必要条件之一。血清学试验一般以pH 6-9 为宜，超出此范围可影响抗原和抗体的理化性质，导致假阳性或假阴 性结果。当 pH 为 3 左右时，接近细菌抗原的等电点，可出现非特异性酸凝集， 造成假象。
4.作用时间
抗原抗体反应应有足够的时间，不同反应时间不同。此外，抗 原抗体反应在液相中反应时，适当振荡与搅拌，也可促进抗原抗体分子的接触， 加速反应。
1.4 抗原抗体反应的类型
现代免疫学技术发展很快，在经典血清学试验方法基础上，新的免疫学测定 方法日益增多，使方法的敏感性、特异性和稳定性都有不同程度的提高，检测目 的物也越来越多。根据抗原抗体反应所产生的现象和结果的不同，把抗原抗体反 应分为 5 种类型:
- 可溶性抗原与相应抗体结合所产生的沉淀反应。
- 颗粒性抗原与相应抗体结合所发生的凝集反应。
- 抗原抗体结合后激活补体所致的补体结合反应。
- 细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应。
- 免疫标记的抗原抗体反应。
二、实验
2.1 凝集反应–ABO血型鉴定
[目的]
- 掌握凝集反应的定义及血型鉴定实验的原理。
- 掌握血型鉴定实验的操作及结果的正确观察与判断。
- 了解血型鉴定实验的用途。
[原理]
凝集反应定义:在一定浓度的电解质环境中，颗粒性抗原(红细胞、细 菌、乳胶颗粒等)和相应抗体反应能够产生肉眼可见的凝集块。
凝集反应：
- 直接凝集
- 间接凝集
- 间接凝集抑制试验
- 抗球蛋白试验
间接凝集抑制反应原理示意图
血型是指红细胞的血型，是根据红细胞膜外表面存在的特异性抗原(镶嵌于 红细胞膜上的糖蛋白和糖脂)来确定的，这种抗原或凝集原是由遗传决定的。 A、B抗原主要表达在红细胞膜上，以糖蛋白或糖脂的形式，呈树枝状突出细胞表 面。 根据红细胞膜上 A 抗原与 B 抗原的有无，可以将血液分为 4 型:如果只存 在 A抗原，则称为A型;只存在B抗原，则称为B型;若A与B两种抗原都存在， 则 称为AB型;这两种抗原都没有的，则称为 O型。
[材料]
- A型和B型标准血清。
- 载玻片、采血针、牙签、棉签，碘酒，酒精。
[方法]
- 取载玻片，在两端分别滴加一滴 A型和B型标准血清，注意不要使两者混合;
- 酒精消毒指端皮肤，用一次性采血针刺破皮肤，挤出少量血液，加在玻片 A、B两端，并立即用无菌干棉球压迫止血;
- 分别用两根牙签混匀;
- 静置3~5分钟，观察凝集现象，判定实验结果。
[结果]
[注意事项]
- 用碘酒与酒精认真消毒采血部位;
- 勿用力挤压采血部位防止红细胞溶解，防止血液凝固;
- 应在 3~5min 内观察结果。
[临床意义]
- 输血:输血前必须检查血型，选择血型相同的供血者，进行交叉配 血，只有完全相合才能输血。
- 母婴 ABO 血型不合引起的新生儿溶血病，主要是依靠血型血清学检 查来诊断。
- 器官移植时受者与供者也必须 ABO血型相符合才能移植，血型不符极 易引起急性排异反应、导致移植失败。
- ABO 血型与疾病之间的联系也有一些报道，某些看来与造血系统无关 的疾 病实际上可能与红细胞血型抗原有关。
[思考题]
输血反应的发生机制及后果?
2.2 凝胶内沉淀反应 –对流免疫电泳
[目的]
掌握对流免疫电泳的操作步骤、结果观察及实际应用，并在此基础 上了解各类沉淀反应的特点。
[原理]
沉淀反应是指可溶性抗原在有适量电解质存在的条件下与相应的抗 体结合， 形成肉眼可见的沉淀物。可分为:
对流免疫电泳实质是将双向扩散试验与电泳相结合的定向加速的免 疫扩散技术。是指在适宜缓冲液和电场条件下，抗原和相应抗体在琼脂凝胶 中，由于电泳和电渗作用，抗原向正极移动，抗体向负极移动。将抗原放负 极端，抗体放正 极端，则抗原抗体相向移动，在两孔之间相遇，在比例合 适时形成沉淀线。
[材料]
载玻片、打孔器、三角烧瓶、移液管、洗耳球、1.2%的琼脂、记 号笔; 酒精灯、火柴、电炉、电泳仪、电泳槽;微量加样器; 抗原及抗体样品
[方法]
- 制板:取干燥洁净的载玻片一块用记号笔注明正极和负极，然后放于 水平台上，倾注加热熔化的 1.2%的琼脂 4ml，制成厚薄均匀的琼脂板。
- 打孔:待琼脂凝固后，用打孔器在琼脂板上打孔，孔径3mm，孔距 3~ 5mm。
- 封底:用酒精灯小心烘烤琼脂板背面玻璃，或用琼脂板背面玻璃在酒 精灯 外焰切割 2~3次，使琼脂与玻璃板贴紧。
- 加样:用微量加样器分别加抗原、抗体 7μl，抗原加在靠近负极的孔 内，抗体加在靠近正极的孔内。
- 电泳:将琼脂板放在电泳槽上，玻片上标正极端与负极端分别接电源 正极和负极，各用 2-3层纱布将琼脂板两端与电极槽缓冲液相连接，接电压 4-6v/cm 或4mA /cm 电泳 25~30 分钟。电泳完闭，关闭电源，取出琼脂板， 在黑色背景上方，观察两孔间抗原抗体复合物形成的白色沉淀线，记录结 果。
[结果]
抗原孔和抗体孔之间出现白色的沉淀线。
[注意事项]
- 制备的琼脂板应边缘整齐，表面光滑，打孔时不要弄破琼脂板;
- 加样以盖满小孔为宜，加样不能太少或溢出;
- 应将抗原端放在电泳槽的阴极端。
[思考题]
- 本次实验结果如果发现，抗原孔和抗体孔之间没有出现沉淀线，可能 有哪些情况?
- 本次实验结果,如果抗原、抗体的正极和负极放反了，能出现沉淀线吗? 为什么?
- 抗原抗体反应检测的意义有哪些?
2.3 其他沉淀反应
2.3.1 单向免疫扩散(Single immunodiffusion)
在含有特异抗体的琼脂 板中 打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体 相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。同时用标 准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标 本的抗原浓度(mg/ml或U/ml)。 应用这一实验方法可检测正常人群或患 者血清中 IgG、IgA 及IgM的水平。
2.3.2 双向免疫扩散(Double immunodiffusion)
双向免疫扩散是指可溶 性抗 原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散,彼此相遇后形成一定类型 的特异性沉淀线。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相 互间比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原、抗体存在多个系统 时，可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。依据沉淀线的形态、条数、清晰度及 位置可了解抗原或抗体的若干 性质，如浓度、特异性等。
2.3.3 火箭免疫电泳(rocketimmunoelectrophoresis，RIEP)
是将单向免 疫 扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。电泳时，含于琼脂凝胶中的抗体 不发生 移动，而在电场的作用下促使样品中的抗原向正极泳动。当抗原与抗 体分子达到 适当比例时，形成一个形状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰， 峰的高度与捡样中的抗原浓度呈正相关。因此，当琼脂中抗体浓度固定时，以 不同稀释度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标，抗原浓度为横坐标，绘 制标准曲线。根据样品 的沉淀峰长度即可计算出待测抗原的含量;反之，当 琼脂中抗原浓度固定时，便可测定待测抗体的含量(即反向火箭免疫电泳)。
火箭免疫电泳
参考资料
- 《医学免疫学》课件 新乡医学院 宋向凤、张国俊、徐春阳、孙爱平、孙书明、赵铁锁等老师
