【1.6.1】实验--抗原抗体反应

一、原理

1.1 抗原抗体反应

抗原与相应抗体的特异性结合反应称为抗原抗体反应。抗原抗体反应既可在 体内作为体液免疫应答的效应机制自然发生,也可在体外作为免疫学实验的结果 出现。在体内,可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用,有时亦可引起 免疫病理损伤;在体外,根据相应抗原物理性状(颗粒状或可溶性)以及反应的条 件(电解质、补体等)不同,可出现凝集、沉淀、细胞溶解和补体结合等反应。

1.2 抗原抗体反应的特点

  1. 特异性 :一种抗原分子通常只能与其刺激机体后产生的抗体结合,这种特 异性的物质基础是抗原分子的表位和抗体分子高变区。
  2. 比例性 :是指抗原与抗体发生可见反应需要遵循一定的量比关系。
  3. 可逆性 :抗原与抗体结合成复合物后,在一定条件下又可解离为游离的抗 原和抗体。
  4. 阶段性 :抗原抗体反应可分为两个阶段:(1)结合阶段:抗原与抗体发 生特异性结合,时间较快,一般肉眼不可见;(2)反应阶段:在电解质、温 度、PH 等适宜条件存在下,形成肉眼可见免疫复合物的反应阶段,时间较长。

1.3 影响抗原抗体反应的因素

影响抗原抗体反应的因素较多,主要有两方面:一方面是受到抗原、抗体的 自 身因素的影响;另一方面是受到电解质、酸碱度、温度及时间等实验环境因素 的 影响。

1.电解质

抗原抗体结合后由亲水性变为疏水性,此时易受电解质影响,如 有适当浓度电解质存在,就会使抗原抗体失去一部分电荷而相互凝集或沉淀,出 现可见反应;若无电解质存在,则不出现可见反应。通常在血清学试验中,以 8.5g/L NaCl 溶液作为抗原抗体的稀释液及反应液,其中 Na+和 Cl-可分别中和胶 体颗粒上的电荷,使胶体颗粒的电势下降,形成可见的沉淀物或凝集物。但如果 电解质浓度过高,则会出现非特异性蛋白质沉淀,即盐析。补体参与的溶细胞反 应,除需要等渗的 NaCl 溶液外,还需适量的 Mg2+和 Ca2+离子参与。

2.温度

抗原抗体反应一般在 15~40°C范围内均可进行,最适温度为 37°C。 在此范围内温度越高,分子运动速度加快,增加抗原抗体接触机会,反 应速度越 快,但亦容易引起复合物解离;温度越低,反应速度缓慢,但抗原抗体 结合牢固,易于观察。某些特殊的抗原抗体反应需要特定的温度,如冷凝集素在 4°C时与红细胞结合,20°C以上反而解离。

3.酸碱度

合适的 pH 是抗原抗体反应的必要条件之一。血清学试验一般以pH 6-9 为宜,超出此范围可影响抗原和抗体的理化性质,导致假阳性或假阴 性结果。当 pH 为 3 左右时,接近细菌抗原的等电点,可出现非特异性酸凝集, 造成假象。

4.作用时间

抗原抗体反应应有足够的时间,不同反应时间不同。此外,抗 原抗体反应在液相中反应时,适当振荡与搅拌,也可促进抗原抗体分子的接触, 加速反应。

1.4 抗原抗体反应的类型

现代免疫学技术发展很快,在经典血清学试验方法基础上,新的免疫学测定 方法日益增多,使方法的敏感性、特异性和稳定性都有不同程度的提高,检测目 的物也越来越多。根据抗原抗体反应所产生的现象和结果的不同,把抗原抗体反 应分为 5 种类型:

  1. 可溶性抗原与相应抗体结合所产生的沉淀反应。
  2. 颗粒性抗原与相应抗体结合所发生的凝集反应。
  3. 抗原抗体结合后激活补体所致的补体结合反应。
  4. 细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应。
  5. 免疫标记的抗原抗体反应。

二、实验

2.1 凝集反应–ABO血型鉴定

[目的]

  1. 掌握凝集反应的定义及血型鉴定实验的原理。
  2. 掌握血型鉴定实验的操作及结果的正确观察与判断。
  3. 了解血型鉴定实验的用途。

[原理]

凝集反应定义:在一定浓度的电解质环境中,颗粒性抗原(红细胞、细 菌、乳胶颗粒等)和相应抗体反应能够产生肉眼可见的凝集块。

凝集反应:

  • 直接凝集
  • 间接凝集
  • 间接凝集抑制试验
  • 抗球蛋白试验

间接凝集抑制反应原理示意图

血型是指红细胞的血型,是根据红细胞膜外表面存在的特异性抗原(镶嵌于 红细胞膜上的糖蛋白和糖脂)来确定的,这种抗原或凝集原是由遗传决定的。 A、B抗原主要表达在红细胞膜上,以糖蛋白或糖脂的形式,呈树枝状突出细胞表 面。 根据红细胞膜上 A 抗原与 B 抗原的有无,可以将血液分为 4 型:如果只存 在 A抗原,则称为A型;只存在B抗原,则称为B型;若A与B两种抗原都存在, 则 称为AB型;这两种抗原都没有的,则称为 O型。

[材料]

  1. A型和B型标准血清。
  2. 载玻片、采血针、牙签、棉签,碘酒,酒精。

[方法]

  1. 取载玻片,在两端分别滴加一滴 A型和B型标准血清,注意不要使两者混合;
  2. 酒精消毒指端皮肤,用一次性采血针刺破皮肤,挤出少量血液,加在玻片 A、B两端,并立即用无菌干棉球压迫止血;
  3. 分别用两根牙签混匀;
  4. 静置3~5分钟,观察凝集现象,判定实验结果。

[结果]

[注意事项]

  1. 用碘酒与酒精认真消毒采血部位;
  2. 勿用力挤压采血部位防止红细胞溶解,防止血液凝固;
  3. 应在 3~5min 内观察结果。

[临床意义]

  1. 输血:输血前必须检查血型,选择血型相同的供血者,进行交叉配 血,只有完全相合才能输血。
  2. 母婴 ABO 血型不合引起的新生儿溶血病,主要是依靠血型血清学检 查来诊断。
  3. 器官移植时受者与供者也必须 ABO血型相符合才能移植,血型不符极 易引起急性排异反应、导致移植失败。
  4. ABO 血型与疾病之间的联系也有一些报道,某些看来与造血系统无关 的疾 病实际上可能与红细胞血型抗原有关。

[思考题]

输血反应的发生机制及后果?

2.2 凝胶内沉淀反应 –对流免疫电泳

[目的]

掌握对流免疫电泳的操作步骤、结果观察及实际应用,并在此基础 上了解各类沉淀反应的特点。

[原理]

沉淀反应是指可溶性抗原在有适量电解质存在的条件下与相应的抗 体结合, 形成肉眼可见的沉淀物。可分为:

对流免疫电泳实质是将双向扩散试验与电泳相结合的定向加速的免 疫扩散技术。是指在适宜缓冲液和电场条件下,抗原和相应抗体在琼脂凝胶 中,由于电泳和电渗作用,抗原向正极移动,抗体向负极移动。将抗原放负 极端,抗体放正 极端,则抗原抗体相向移动,在两孔之间相遇,在比例合 适时形成沉淀线。

[材料]

载玻片、打孔器、三角烧瓶、移液管、洗耳球、1.2%的琼脂、记 号笔; 酒精灯、火柴、电炉、电泳仪、电泳槽;微量加样器; 抗原及抗体样品

[方法]

  1. 制板:取干燥洁净的载玻片一块用记号笔注明正极和负极,然后放于 水平台上,倾注加热熔化的 1.2%的琼脂 4ml,制成厚薄均匀的琼脂板。
  2. 打孔:待琼脂凝固后,用打孔器在琼脂板上打孔,孔径3mm,孔距 3~ 5mm。
  3. 封底:用酒精灯小心烘烤琼脂板背面玻璃,或用琼脂板背面玻璃在酒 精灯 外焰切割 2~3次,使琼脂与玻璃板贴紧。
  4. 加样:用微量加样器分别加抗原、抗体 7μl,抗原加在靠近负极的孔 内,抗体加在靠近正极的孔内。
  5. 电泳:将琼脂板放在电泳槽上,玻片上标正极端与负极端分别接电源 正极和负极,各用 2-3层纱布将琼脂板两端与电极槽缓冲液相连接,接电压 4-6v/cm 或4mA /cm 电泳 25~30 分钟。电泳完闭,关闭电源,取出琼脂板, 在黑色背景上方,观察两孔间抗原抗体复合物形成的白色沉淀线,记录结 果。

[结果]

抗原孔和抗体孔之间出现白色的沉淀线。

[注意事项]

  1. 制备的琼脂板应边缘整齐,表面光滑,打孔时不要弄破琼脂板;
  2. 加样以盖满小孔为宜,加样不能太少或溢出;
  3. 应将抗原端放在电泳槽的阴极端。

[思考题]

  1. 本次实验结果如果发现,抗原孔和抗体孔之间没有出现沉淀线,可能 有哪些情况?
  2. 本次实验结果,如果抗原、抗体的正极和负极放反了,能出现沉淀线吗? 为什么?
  3. 抗原抗体反应检测的意义有哪些?

2.3 其他沉淀反应

2.3.1 单向免疫扩散(Single immunodiffusion)

在含有特异抗体的琼脂 板中 打孔,并在孔中加入定量的抗原,当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体 相结合,即形成白色沉淀环,其直径或面积与抗原浓度呈正相关。同时用标 准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线,即可用以定量检测未知标 本的抗原浓度(mg/ml或U/ml)。 应用这一实验方法可检测正常人群或患 者血清中 IgG、IgA 及IgM的水平。

2.3.2 双向免疫扩散(Double immunodiffusion)

双向免疫扩散是指可溶 性抗 原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散,彼此相遇后形成一定类型 的特异性沉淀线。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相 互间比例,而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原、抗体存在多个系统 时,可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。依据沉淀线的形态、条数、清晰度及 位置可了解抗原或抗体的若干 性质,如浓度、特异性等。

2.3.3 火箭免疫电泳(rocketimmunoelectrophoresis,RIEP)

是将单向免 疫 扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。电泳时,含于琼脂凝胶中的抗体 不发生 移动,而在电场的作用下促使样品中的抗原向正极泳动。当抗原与抗 体分子达到 适当比例时,形成一个形状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰, 峰的高度与捡样中的抗原浓度呈正相关。因此,当琼脂中抗体浓度固定时,以 不同稀释度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标,抗原浓度为横坐标,绘 制标准曲线。根据样品 的沉淀峰长度即可计算出待测抗原的含量;反之,当 琼脂中抗原浓度固定时,便可测定待测抗体的含量(即反向火箭免疫电泳)。

火箭免疫电泳

参考资料

  • 《医学免疫学》课件 新乡医学院 宋向凤、张国俊、徐春阳、孙爱平、孙书明、赵铁锁等老师
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