【6.2.1】单克隆抗体的人源化及同步优化

antibody 阅读量：次

单克隆抗体通常能够以高亲和力识别抗原并中和其功能。另外，单克隆抗体在与表达相应抗原的细胞结合后，还能通过抗体 Fc段来触发 ADCC 或 CDC 效应功能，进而靶向清除掉这些细胞。在自身免疫疾病治疗领域，一些能够中和炎症细胞因子（如 IL-6受体或肿瘤坏死因子）功能的抗体就能够对风湿性关节炎患者起到显著疗效；在肿瘤治疗领域，一些能够识别相关肿瘤抗原（如 CD52或CD20）的抗体，能够通过触发效应功能对表达相应抗原的肿瘤起到杀伤清除作用，进而给肿瘤患者带来生存获益。相较于传统的小分子药物，单克隆抗体在对某一些疾病上已显现出更佳的疗效以及更小的副作用。目前，单克隆抗体已在多个疾病治疗领域扮演重要角色。截止2018年6月，已有73个重组单克隆抗体获得了FDA批准，另外还有700多个新的候选药物进入到了临床试验阶段。

不过，在单克隆抗体药物取得如今的成功之前，早期那些通过杂交瘤技术获得的鼠源抗体往往由于会产生人抗鼠抗体（human anti-murine antibody，HAMA）应答，而在临床研究上受到很大阻碍。HAMA 应答导致了鼠源单克隆抗体在人体内会很快被清除，半衰期很短，进而对鼠源抗体的临床疗效带来了限制。

为了解决该问题，研究人员借助抗体工程技术逐步研发出了嵌合抗体和人源化抗体，以试图减小单克隆抗体在人体内产生免疫原性的可能性（如图1）。人-鼠嵌合抗体是将鼠源抗体的恒定区替换为人源抗体的恒定区，以大幅减少了免疫原性风险。人源化抗体则是将人-鼠嵌合抗体上鼠源抗体互补决定区 (CDRs) 移植到人源抗体的框架区 (FRs) 中，在保持嵌合抗体活性的同时，进一步降低了其免疫原性的风险。其实，当前治疗性抗体取得成功，很大程度上是要归因于这种被称为 CDR-grafting的人源化改造技术。

Fig. 1 Theconstruction of chimeric and humanized antibodies. The bulk of the humanized Ab(so-called frameworks-in orange) is tolerated as if “self.” The complementaritydetermining regions (CDRs) which bind antigen will however be regarded by theimmune system as foreign

之后，一些新的技术也逐步被报道出来，试图进一步减弱 CDR-grafting 人源化抗体的潜在免疫原性。为了降低人源化抗体框架区残基的潜在免疫原性，研究人员在选择人源化抗体框架区模板时，会优先使用人的胚系基因序列（germline sequences）或共有序列 (consensus sequences) 来作为模板来源，而非选择那些可能带有高频体细胞突变 (somatic mutation) 的框架序列。在此基础上，为了更进一步降低抗体 CDR 序列上鼠源残基的潜在免疫原性，研究者们又发明了被称为 SDR-grafting 的抗体人源化技术，该方法并不需要将整个鼠源 CDRs 都移植到人的框架区中，而只是将 CDR 序列中对抗原结合活性所必需的特异性决定残基 (Specificity Determining Residues, SDR) 移植到人的框架区中。这种 SDR-grafting 方法更进一步地提升了人源化抗体的人源性（即与人 germline 序列的相似性），并尽可能地减少了鼠源 CDRs 中效应 T 细胞表位的数量，从而将抗体可变区潜在的免疫原性风险也做到最小化。

目前治疗性单克隆抗体的市场竞争非常激烈，尤其是针对那些已验证的靶点，因此有必要开发出高度优化的抗体，而非简单的人源化抗体。高度优化的人源化抗体应具备对临床疗效而言较为关键的药理学性质（例如较高的抗原结合活性和较长的半衰期），以及对商业化开发而言较为重要的生物物理学性质（例如稳定性和表达量）。为了获得高度优化的抗体，在抗体人源化设计及筛选的过程中，就应将这些药理学和生物物理学性质的要求考虑进去。

为了获得高度优化的单克隆抗体，人源化改造需经历五个步骤：

  1. 通过同源建模建立亲本非人源抗体的 3D 结构模型；
  2. 针对抗原结合活性、免疫原性、表达、稳定性和药代动力学，选择合适的受体人源抗体框架；
  3. 针对设计获得的多版本人源化抗体构建相应的表达载体；
  4. 将这些人源化抗体进行表达纯化；
  5. 最后一步，对这些纯化获得的人源化抗体进行多维度的评价筛选。

一、抗体人源化

1.1 构建亲本可变区的结构模型

在没有获得亲本非人源抗体晶体结构的情况下，首先需要通过建模的手段来获得该抗体的同源模型。基于同源性和构象搜索算法，许多完善的抗体建模程序已被开发出来。目前，融合这些建模方法的计算机软件也得到了商业化应用。

1.2 选择框架区

选择合适的受体人源框架时，需要考虑四个关键性要素——免疫原性、抗原结合活性、表达、稳定性以及药代动力学，这是获得高度优化人源化抗体最重要的步骤。常规的 CDR-grafting 方法是将亲本 CDRs 移植到单个受体人源框架中（即 FR1,FR2,FR3 和 FR4 均来自同一个germline 序列），它通常很难同时满足上述四个关键要素。在这种情况下，应针对每一个非人源框架区（即 FR1,2,3及4），分别选择最合适的人 germline 框架区去进行人源化，同时考虑四个所有关键要素（图1）。这种被称作 framework shuffling 的人源化方法可以选择出更为理想的人框架区，从而获得高度优化的人源化抗体。这样的人源化抗体不仅具有较低的免疫原性，而且还具备较高的稳定性和表达量，以及较长的半衰期。

  1. 通过蛋白数据库（如 IMGT, V BASE, EMBL 或 NCBI），将亲本非人源抗体的每一个框架区（重链的 FR1,2,3,4 和 轻链的 FR1,2,3,4 ）与人 germline 框架区序列进行同源比对。

  2. 确定在免疫球蛋白功能区中组成上部疏水核心的氨基酸残基：在亲本非人源抗体重链中，这些氨基酸位于 FR1的第2，4，24，27 和 29 位， FR3 的第69，71，78和94位；在轻链中，这些氨基酸位于 FR1 的第2，4位， FR3 的第64，66和71位（氨基酸残基位置的确定是按照Kabat numbering scheme进行 ）（表1）。

  3. 针对亲本非人源抗体的每一个框架区，选择人 germline 框架序列作为模板，该模板应完全保留了亲本抗体上端疏水核心的所有氨基酸残基。在对亲本抗体每一个框架区进行人源化改造时，可选择不同的人 germline 框架序列。该过程是确保人源化抗体维持抗原结合活性最重要的一步。

  4. 在所选的人 germline 框架序列中，确定四种关键结构中的氨基酸残基，以获得较高表达及稳定性的人源化抗体。这四种关键结构残基如下：构成上部及下部疏水核心的疏水残基，它们对免疫球蛋白功能区的组装以及 FR1构象的形成非常重要；构成免疫球蛋白功能区中氢键网络的亲水残基；转角结构（phi-angle）中的氨基酸残基；VH-VL接触面残基（表1）。

  5. 在 germline 亚群中，上述所有这些氨基酸是高度保守的，尤其是在 VH 结构域中。为了选择合适的与亲本框架同源的人 germline 框架，需要比较亲本非人源抗体与人germline 抗体之间这些一致性氨基酸以及结构模型（表1）.综合考量序列及结构的相似性，选择在正确位置上具有正确氨基酸的人germline框架作为模板。

  6. 确定亲本抗体框架区中可能会影响抗原结合活性的氨基酸位点。表1中对这些可能会影响结合活性的氨基酸残基进行了总结。通过对亲本抗体进行同源建模，来判断这些氨基酸位点是否会与抗原进行相互作用。

  7. 将亲本非人源抗体框架序列与具有最高同源性的亲本非人源 germline框架序列进行对比，找出框架区中的独特氨基酸位点。框架区中这些源于体细胞突变的独特氨基酸可能会影响抗原结合活性。

  8. 为了获得半衰期长的人源化抗体，要选择低等电点（pI）的框架，这些框架序列中通常 Glu 和 Asp 残基较多，而 Arg 和 Lys 残基较少。

  9. 确定所选germline框架序列在人的抗体中被使用的频率。如果使用频率非常低，它在某些个体中可能会产生免疫原性。因此通常需要考虑选择那些被使用频率较高的 germline 序列了。

  10. FR4 中没有关键性氨基酸残基，因此可以通过同源比对选择在抗体 J 区具备最高同源性的人 germline 序列作为 FR4 的序列。

  11. 比对经设计获得的人源化抗体与亲本非人源抗体的框架区序列。

  12. 找出两者框架区序列中存在差异的氨基酸位点。

  13. 根据对亲本抗体的同源建模结果，确定这些存在差异的氨基酸位点是否会影响 CDR 的构象或抗原结合活性。

  14. 确定所选的人germline框架序列中是否含有潜在的化学修饰位点，如脱酰胺位点（Asn-Gly），异构化位点（Asp-Gly），暴露在表面的蛋氨酸残基以及糖基化位点（Asn-X-Ser/Thr，其中 X ≠ Pro）等。

  15. 再次确定上述1-14步骤，确保没有遗漏。

  16. 综合考量稳定性，免疫原性（germline 使用频率），药代动力学（等电点）和化学修饰位点等， 最终确定选择合适的人 germline 框架序列。

  17. 选择人源的信号肽序列，该信号肽来源于人源化抗体中 FR1 原本所在的人germline 序列。

Fig.1 Selecting the acceptor human framework by framework shuffl ing. Each acceptorframework is selected from different germline framework for generatinghumanized antibody. In this case, humanized antibody is generated by usinggermline A as framework1, germline B as framework2, germline C as framework3,and J region as framework4

Table 1 Sequence alignmentof key residues of the human consensus VH and VL families

1.3 多版本人源化抗体的设计

将选定的人源 germline 框架与亲本非人源 CDRs 进行拼接后，要将注意力放在人框架序列与亲本CDR序列的边界区域。例如，连接人框架序列与亲本CDR序列后，可能会在两者边界区产生潜在的脱酰胺、异构化、糖基化位点等。出现这样的潜在修饰位点有可能会影响到该人源化抗体的商业化开发。

此外，对框架区与CDR区之间边界序列的关注还可能有助于减少人源化抗体的免疫原性，增加其人源性。在设计的过程中，需要确定经设计的边界区域是否与相应的人germline边界序列相匹配。如果不匹配，可以考虑换用别的人源 germline 框架作为受体框架。例如，在轻链框架序列上，第22和23位的氨基酸通常是以 Thr-Cys,Ser- Cys 或 Asn-Cys为主。当轻链CDR区上第 24 和 25 位氨基酸为 Arg-Ser 时，则框架区第 22 和 23 位氨基酸一般会限定为 Ser-Cys 或 Asn-Cys。如果此时所选的框架序列在第 22 和 23 位的序列为Thr-Cys，而非 Ser-Cys 或 Asn-Cys，则该可变区潜在免疫原性风险会相对较高。在这种情况下，就应该考虑是否需要选择那些在第 22 和 23 位为 Ser-Cys 或 Asn-Cys 的人germline 序列来作为该框架区的模板

1.4 人源化抗体的表达与纯化

根据所设计的人源化抗体可变区的氨基酸序列来合成相应的重链和轻链的 DNA片段（包含信号肽、人源化的可变区和人的恒定区），然后将这两条 DNA 片段并分别插入到哺乳动物细胞表达载体中，从而获得该人源化抗体相应的重链和轻链表达载体。通过进行瞬时表达（如 FreeStyle 293 Expression System）、上清收集及纯化（如 rProtein A SepharoseTM Fast Flow）获得相应人源化抗体，并进行抗体浓度的测定。

二、人源化抗体的评估

为了获得高度优化的人源化抗体，对人源化抗体的评估应包括以下方面：抗原结合活性、免疫原性、药代动力学、热稳定性（熔解温度）和高温下的加速稳定性研究。然而，如果对所获得的大量人源化抗体都进行上述所有性质的评估，那显然不是一种高效的筛选方式，因为有些人源化抗体的抗原结合活性会低于亲本非人源抗体。因此，抗原结合活性检测（如 Biacore KD值测定）、热稳定性分析(如 Differential Scanning Calorimetry Analysis)、表达水平分析(如分光光度计、Biacore 或 ELISA 等检测法)、聚集倾向分析（Size Exclusion Chromatography Analysis）等这些易于操作的评估手段才是筛选高度优化人源化抗体的首轮筛选方法。

三、框架区回复突变点的分析

通过选择保留了所有上部疏水核心及关键结构氨基酸残基的 FR1,2,3和4序列，设计获得的人源化抗体往往能够保留住于亲本抗体相当的抗原结合活性。如果经这样设计的所有人源化抗体均无法做到这点，则需要考虑对人源化抗体的框架区进行回复突变。

3.1 重组亲本抗体及人源化抗体的重轻链的 VH/VL domain，分析哪个 domain 导致了结合活性的丢失。

(i) Humanized VH/Humanized VL.

(ii) Humanized VH/Parent VL.

(iii) Parent VH/Humanized VL.

(iv) Parent VH/Parent VL.

3.2 将人源化抗体中 VH 或 VL中的人 germline 框架区逐个替换回原先的亲本非人源框架，以判断到底是哪个框架区导致了结合活性的丢失。

(a) pGL FR1_hGL FR2_hGL FR3_hGL FR4.

(b) hGL FR1_pGL FR2_hGL FR3_hGL FR4.

(c) hGL FR1_hGL FR2_pGL FR3_hGL FR4.

(d) hGL FR1_hGL FR2_hGL FR3_pGL FR4.

（hGL 表示所选的人 germline 框架区序列，pGL 表示亲本非人源抗体框架区序列）

3.3 比对人germline框架区与亲本非人源框架区之间的氨基酸序列，以鉴别哪一个或哪一些氨基酸决定了抗原结合活性。

通过构建的同源模型来判断这些氨基酸的所在位置，来判别它们是否需要被同时替换掉。如果这些存在差异的氨基酸在空间位置上比较靠近，那么它们很可能是共同参与影响了抗原结合活性，需要将它们全部都回复突变为亲本氨基酸序列。反之，它们在空间位置上彼此并不靠近，它们则有可能是单独地影响了抗体结合活性，这时就需要分别去替换这些氨基酸位点。

四、高度人源化抗体的筛选

通过上述首轮筛选获得一些具备与亲本非人源抗体相近抗原结合活性的人源化抗体之后，还需要对这些抗体进行药代动力学分析以及免疫原性风险评估，以作为第二轮筛选从而获得最终高度优化的人源化抗体。

4.1 药代动力学

①通过单次静脉或皮下注射的方式，将人源化抗体以合适的剂量注入 C57BL/6J 普通小鼠体内。

②选择合适的时间收集小鼠血样。

③采用 anti-human IgG ELISA 方法来检测小鼠血浆中的抗体浓度。

④通过血浆浓度-时间数据来分析计算药代动力学参数（消除半衰期、清除率、生物利用度）

4.2 免疫原性

①通过软件工具——例如 Epibse (Lonza Inc.)、iTope/TCED (Antitope Ltd.) 和 EpiMatrix (EpiVax Inc.) 来对人源化抗体上的 T 细胞表位数量进行预测。

②通过检测多肽与 MHC classⅡ 结合活性的 HLA 结合实验，或者使用多肽进行体外T细胞实验来评估潜在的免疫原性。实验中的多肽序列则是通过软件预测来挑选出来的。这两种实验可以找出人源化抗体中具有潜在免疫原性的肽段。

③通过体外 T 细胞实验（ELISPOT 或 T细胞增殖实验）来检测T细胞对人源化抗体的免疫响应，从而分析整个人源化抗体的潜在免疫原性。

4.3 筛选高度优化的人源化抗体

通过上述筛选流程可获得不同人源化抗体的药理学和生物物理学性质，综合比较这些性质即可筛选出高度优化的人源化抗体。在人源化抗体的筛选中，如果有一个抗体分子在药理学和生物物理学性质上均表现突出，那么它就可以直接被作为临床候选分子。然而，这种情况非常罕见，大多数情况是这些人源化抗体可能只在某一些属性是优越的，但是其他属性上却又并不那么突出。因此，在筛选过程中应对人源化抗体的关键要素 (抗原结合活性、免疫原性、稳定性/表达、药代动力学) 进行优先考虑。如果某一抗体药物的剂型需要被开发成稳定且高浓度的皮下注射剂，那么在该抗体的人源化筛选过程中，稳定性和药代动力学就成了更需优先考量的要素。另外，在肿瘤疾病治疗领域，由于癌症患者体内的免疫反应往往较弱，因此相应的抗体药物的免疫原性可能在其人源化筛选过程中并不是最优先考虑的。

四、 总结

在众多获得人源抗体的方法中（如：人源化小鼠，噬菌体/酵母展示技术，单B细胞克隆等），鼠源抗体人源化技术无疑是被应用最久，也是最多的一种。用抗体人源化方法做抗体药物具有成本低，速度快，成药性好且无技术专利风险等诸多优势。随着抗体药市场的逐步扩大，加上最近兴起细胞治疗（如CAR-T）也需要包含人源抗体，该技术必将得到更多，更广泛的应用。在应用过程中，本文中阐述的方法也会逐步进行完善，人源化抗体的性质也会在抗原结合活性、免疫原性、药代动力学、热稳定性各方面展现更好的效果，从而成为更好的药物候选。

参考资料

这里是一个广告位，，感兴趣的都可以发邮件聊聊：tiehan@sina.cn
个人公众号，比较懒，很少更新，可以在上面提问题，如果回复不及时，可发邮件给我： tiehan@sina.cn