【2.7.1】纳米抗体（nanoantibody,VHH,sdAb）
VHH (also called nanobodies, single domain antibodies, or sdAb)
一、纳米抗体介绍
纳米抗体(nanobody,Nb)， 即重链单域抗体VHH(variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody)——骆驼体内存在着天然缺失轻链的重链抗体(heavy-chain antibody,HCAb)，克隆其可变区VHH而得到的只由一个重链可变区组成的单域抗体，是目前可以得到的具有完整功能的稳定的可结合抗原的最小单位。其相对分子质量为15000，仅为常规抗体的1/10左右，分子高度4.8 nm，直径2.2 nm，为纳米级，故被称为纳米抗体。
骆驼重链抗体的VHH和人抗体重链可变区VH结构非常相似，包含三个高变区(hypervariableregion,HVR)和其两侧的四个骨架区(frameworkregion,FR)，且其基因同源性达90%。 VHH由两个β片层形成支架，三个高变区聚集在一侧参与抗原识别。通过比较可以看出：与骆驼的重链抗体相比，纳米抗体仅由重链可变区组成。
抗体结构示意图
(A) 传统四链结构抗体； (B) 骆驼血液中的重链抗体；(C ) 稳定的可结合抗原的最小单位VHH即纳米抗体
1.1. 纳米抗体分类
利用纳米抗体所具有的特性，对其进行基因改造，可转变为多种形式，携带某些特定的结构，用于疾病的诊断和治疗。
单价纳米抗体
即用特异性的抗原从纳米抗体库中筛选得到的抗原特异性的纳米抗体，因其表面有大量的亲水残基，能保持严格的单体结构，且仅以这种单体形式就能高特异性、高亲和力地与其抗原相结合。纳米抗体具有严格的单体结构，能防止蛋白质聚集，一些纳米抗体甚至能清除已形成的聚集体。
多价和多特异性纳米抗体
多价抗体是识别同一种表位的单价抗体的聚合物，比单价抗体具有更高的抗原亲和力；多特异性抗体是识别不同表位的单价抗体的聚合物，能结合不同靶目标或同一靶目标的不同表位，比单价抗体具有更高的抗原识别能力。而纳米抗体结构简单，只有一个结构域，可通过短小的连接序列聚合在一起,从而转换成多价和多特异性的形式。
融合型纳米抗体
纳米抗体具有严格的单体特点且其相对分子质量很小，很容易通过基因工程技术与其他结构(如BSA、IgG-Fc等)结合形成新的融合分子，如能延长其半衰期的酶、抗菌肽或显影物质等。在新的融合分子中，纳米抗体与其靶抗原定向结合，与纳米抗体融合的部分就能发挥相应的功能。进行疾病治疗时，我们希望药物能在体内靶器官停留较长的时间以便提高药物的作用，然而纳米抗体的血液清除速度却很快，不利于它所携带的药物发挥作用。所以，通过基因技术将纳米抗体VHH和寿命较长的分子融合在一起，可以提高纳米抗体在血液中的存在时间即延长其半衰期，从而达到更好的治疗效果。
另外，纳米抗体可连接各种显影物质用于疾病诊断。因其具有高度的靶向性和特异性，通过改变造影剂外壳的组成成分，或在外壳上连接针对组织特异性抗原的抗体或特异受体的配体，可构建针对特定组织的靶向超声造影剂。加之纳米抗体的强穿透力，能穿过血管进入组织，可更好地应用于显像和治疗：如连接绿色荧光蛋白(GFP)和VHH形成复合物，这种复合物能靶向地结合到活细胞，可用于疾病的诊断。
不同类型的纳米抗体
1.2 纳米抗体的结构特征
体积小
相对于普通抗体的6个互补决定区(complementaritydetermining region, CDR)，Nb仅有的3个CDR就具备了特异的抗原结合能力和高亲合力，具有完整的抗原结合片段。
抗原结合环的结构大
纳米抗体的抗原结合环的结构组成比普通抗体VH更大，其CDR1和CDR3比VH的更长——人和小鼠VH的平均长度分别只有14和12个氨基酸， 而纳米抗体的CDR3长度为16～18个氨基酸，加上纳米抗体包含了骨架区的氨基酸残基, 就决定了纳米抗体能补偿抗原结合位点轻链可变区VL的缺乏。
FR2区氨基酸残基改变并存在二硫键
纳米抗体VHH表面大概只有10个氨基酸和人VH不同，其中在FR2位置有四个特异的氨基酸：普通抗体的FR2中V37、G44、L45和W47这4个氨基酸残基是在进化中相当保守的疏水性残基；而在VHH中，它们突变为亲水性的氨基酸残基F37、E44、R45、G47，增加了VHH的溶解性。VHH的CDR1区和骨架区FR2存在半胱氨酸残基(Cys)，可以和CDR3区中的Cys残基形成二硫桥，增加了可变区的稳定性和结构变化。
纳米抗体FR2区中特殊的亲水性氨基酸残基的改变和CDR3区二硫键的存在，使得其稳定性和亲水性也远远优于传统的IgG抗体。
VH 和VHH 结构示意图
1.3 纳米抗体相比传统抗体的突出优势
高水溶性、 高耐性和稳定性
正常抗体VH结构域单独表达时通常形成包涵体，或者暴露的疏水域相互黏附；而纳米抗体VHH由于其FR2中的疏水残基被亲水残基所取代，使得纳米抗体的水溶性增加，聚合性减少；而且即使以包涵体形式表达，也很容易复性，这样可以大大提高作为药物的利用率。
研究发现，一些纳米抗体能耐高温且具有高度的构象稳定性。将不同的纳米抗体在37℃放置1周，结果其抗原结合活性仍均在80%以上，表明纳米抗体在室温下保存相当稳定，这使其比常规抗体更易于储藏和运输。
另外,纳米抗体具有可逆的去折叠能力即易复性，VanderLinden等比较了鼠单抗和纳米抗体在90℃高温长时间处理的抗原结合活性，发现纳米抗体都保持了较高的活性仍能重新获得抗原结合能力，而所有常规抗体在90℃处理后都丧失了活性，发生了不可逆的聚合。而在恶劣条件，如在离液剂、存在蛋白酶和极度pH值变性的条件下(如胃液和内脏中)，正常抗体会失效或分解，而纳米抗体仍具有高度的稳定性。
低免疫原性
免疫原性是指能够刺激机体形成特异性抗体或致敏淋巴细胞的能力，与分子大小、化学结构等有关，相对分子质量越小免疫原性越小。纳米抗体因其相对分子质量很小且只有一个结构域，所以对人体的免疫原性较弱，与人的生物相容性较好。在动物实验中，纳米抗体的重复给药未引起任何体液和细胞免疫应答 (但有报道称若长期重复的临床使用也会产生潜在的免疫原性，有待人们去改善)。因此，可通过带有人同类骨架区VHFR2烙印的纳米抗体来获得非免疫原性的纳米抗体。
较强的组织穿透力
纳米抗体具有强而快的组织穿透能力，可以进入致密的组织如实体瘤等发挥作用；并且多余未结合的纳米抗体能够很快的被清除，这相对于单克隆抗体组织穿透力差、不易被清除的不足，更有利于疾病的诊断。另外，纳米抗体能够有效的穿透血脑屏障，这样的特性为脑部给药提供了新方法，有望成为治疗老年痴呆症的新药。CortezRetamozo等等制备的纳米抗体显影剂呈现出了穿透性好、亲和力高、肿瘤组织的显像效果好，并且对正常组织几乎没有损伤等优点。
高表达性
因纳米抗体相对分子质量小、结构简单，由单一基因编码，所以它很容易在微生物中合成，能在噬菌体、酵母等微生物中大量的表达，而且其相对价格低廉、可进行大规模生产，易于普及和应用。可通过酵母反应器酿造将纳米抗体的产量提高至每公升1g。
1.4 纳米抗体的不足
纳米抗体最大的缺陷是半衰期较短。与常规抗体相比，纳米抗体具有更快的血清清除速度，使得其在体内成像方面大展身手的同时，也限制了其在治疗领域的应用。
为延长纳米抗体在血液中的半衰期，解决方法有聚乙二醇化、与白蛋白结合或融合、与抗体的Fc融合。
较成功的有Coppieters等通过构建双特异性抗体的方法，将特异性抗肿瘤坏死因子纳米抗体和抗血清白蛋白纳米抗体偶联，以延长在血清中的半衰期；Harmsen等使用聚乙二醇化的方法也成功延长了中和手足口病的纳米抗体的半衰期；此外，Hmila等将VHH片段和人Fc段连接在一起，同样有效延长了抗体在体内半衰期。
二、纳米抗体应用
2.1. 疾病体外检测
纳米抗体具有较强的表位识别与结合能力，其构建及表达过程甚至不需要纯化的抗原。纳米抗体体积小，使其能够以高密度牢固地结合于固相载体捕捉微量抗原。这些特性是常规单抗甚至单域抗体所不及的。因此，可以充分发挥以纳米抗体为基础的免疫检测方法的作用，检测与鉴别临床上较难检出的靶点以及外来病原物或毒素。
EGFR在许多肿瘤中过度表达，并且是肿瘤药物靶向的极具吸引力的靶点。目前已开发了靶向EGFR的纳米抗体。并成功应用于乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌的诊断。
2.2. 体内无创伤诊断
纳米抗体与靶点结合的高亲合力、高特异性和优良的组织穿透能力，使其可以被用作靶向示踪分子进行特异的放射免疫显像或靶向超声造影。因此，以纳米抗体为基础的病灶组织特异的靶向示踪成为分子成像领域重要的研究方向。
1）放射免疫显像
放射免疫显像是指将放射性核素通过一定方法标记到抗体上，利用抗体与抗原的免疫结合，特异定位到表达一定抗原的病灶组织上，通过核素发出的射线进行肿瘤特异性显像。
目前，基础研究和临床实际应用还有一定差距。需要改进的是纳米抗体（Nb）与放射性核素的标记技术放射性核素的种类非常多，在选择用于放免显像的核素时，从与Nb的配伍标记角度出发，一般要考虑两个因素：1)核素合理的物理半衰期：由于Nb的半衰期较短，因此，核素的半衰期不能过短。2)核素应为无载体形式；Nb的氨基酸构成一般不足140个，其与核素结合的特定位点有限。因此，只有无载体形式的核素才能得到具有高比活度的标记抗体，这也是获得良好显像的前提。
放射性核素标记抗体的方法分为直接和间接法。直接标记法是放射性核素直接与抗体分子形成价键结合而实现标记。这种标记方法步骤简单，易于实现，但能用于直接标记法的核素有限。间接标记法则是通过联接剂将核素标记在抗体之上，在保持Nb免疫括性的前提下，提高标记率和标记物的稳定性至关重要，因为它直接影响着标记物的生物分布和体外显像质量。
2）靶向超声造影
靶向超声造影是指将特异性抗体或配体连接到超声造影剂表面，使其能主动地与病变组织上相应的抗原或受体靶向结合，并通过超声造影技术显示靶灶部位分子水平病理变化，从而产生特异性的分子显像。
为了在体内快速而准确地检测肿瘤所在位置，理想的显影剂应具备良好的组织渗透性，高抗原亲和力，非特异性噪声背景低，未结合靶抗原的抗体能迅速清除，将放射损伤程度降到最低。CortezRetamozo等以单域抗体作为靶向分子构建的显影剂穿透性好，亲和力高，在数小时内肿瘤组织的显像效果明显提高，在正常的组织中没有发现显影剂的存在。
2.3. 肿瘤靶向治疗
纳米抗体自身的高亲合力和特异性，使得它更容易在阻塞部位与癌症细胞上的受体靶向结合，渗入到血管少的组织内。同时鉴于纳米抗体的低免疫原性，将纳米抗体对小鼠进行重复给药，经检测，没有引起任何体液和细胞免疫反应。
由于纳米抗体可以用于构建多种分子结构，从而可以进行一些分子辅助治疗。如将纳米抗体与阴沟肠杆菌β内酰胺酶相结合，试验证明，此结合物能选择性的激活抗癌前体药物，有效的与结肠腺癌细胞上的癌胚抗原相结合，在原位杀伤肿瘤，从而建立了一种肿瘤异种移植物的治疗方法，且无毒副作用。
跨越血脑屏障治疗神经系统疾病是目前科学家开发和研究的重点内容。纳米抗体能跨越人的血脑屏障内皮细胞，促进药物的运输，为脑部给药提供了新的方法。
药企相继开发了靶向EGFR、HER2、VEGFR2、c-Met、CXCR7等抗肿瘤纳米抗体。
纳米抗体在抗肿瘤靶标方面的研究进展
资料来源：《纳米抗体用于肿瘤诊断与治疗的研究进展》
2.4. 神经系统疾病
纳米抗体可用于治疗淀粉样变疾病。老年痴呆症是一种致死性神经退行性疾病。其病理特征为β－淀粉样蛋白的沉积。运用噬菌体展示技术和原子力显微镜观察技术，发现分离出的E1纳米抗体可以选择性识别、对抗Ａβ低聚物，使E1具备与其他治疗方法相结合治疗AD的潜在价值。比利时纳米抗体药企Ablynx已开发出三株抗老年性痴呆的纳米抗体。
此外，一些纳米抗体甚至能清除已聚合成的聚集体，并在细胞内发挥作用。因而它还可以用来治疗其他淀粉样变疾病，如帕金森病及眼咽型肌营养不良症。
2.5. 循环系统疾病
纳米抗体可制成抗血栓药物。比利时Ablynx公司研制出了一种纳米抗体药物——Ablynx。其中的一种ALX-0081能选择性地阻止血栓的形成。在狒狒的安全模型检测急性血栓形成试验中，与传统的抗栓药物相比，ALX-0081表现出了优越的治疗窗带。
2.6. 感染性疾病
纳米抗体用于治疗轮状病毒引起的腹泻。Pant N等对乳酸菌治疗小鼠腹泻试验中，通过口服给药时，乳酸杆菌表面所表达的VHH能够缩短病程、减轻病症，降低由于轮状病毒引起腹泻导致的小鼠死亡率。据此，可给儿童服用结合了纳米抗体的活菌制剂，从而有效地预防治疗轮状病毒引起的腹泻，且显著降低治疗成本。
纳米抗体还可用于预防及治疗锥虫病、禽流感检测和治疗、鉴别布鲁菌。
2.7. 其他疾病类型
纳米抗体还可用于消化系统疾病、食物中毒检测与治疗等方向。
治疗性纳米抗体研究进展
资料来源：生物制药小编
临床阶段品种有应用于治疗自身免疫病、癌症、血液疾病、病毒感染、骨科疾病、神经退行性疾病产品，除了进入临床研究阶段的纳米抗体，拓展指引在研项目研究方向有抗肿瘤、抗感染、抗炎症性疾病、神经退行性疾病
三、纳米抗体前景
- 口服来调节机体免疫
- 检测和治疗肿瘤
- 诊断探测探针
- 开发双抗夹心法ELISA检测流感等病毒
- VHH非免疫球蛋白支架作为很高的蛋白黏合剂
- 畜牧兽医领域疾病的临床治疗和诊断检测
四、纳米抗体的抗体库建立和筛选以及制备
4.1. 纳米抗体的抗体库建立和筛选
重链抗体来源的纳米抗体由于结构简单，相对于Fab、scFv等片段更容易正确折叠，所以在进行噬菌体抗体库的构建和筛选方面也更加具有优势。此外，有实验室依据纳米抗体表达稳定、相对分子质量小的特点，结合酵母双杂交的技术，开发出在酵母细胞内进行胞内抗体筛选的技术。
4.2 纳米抗体的制备
五、纳米抗体全球竞争格局分析
据悉，2015年全球单克隆抗体药规模达916亿美元，当年增长率7%，预计2018年将达到1122亿美元。如果纳米抗体能够替代其中50%的市场份额，则纳米抗体的全球市场容量将达到561亿美元。
然而，目前纳米抗体行业才刚刚萌芽。海外市场上，只有比利时Ablynx公司深耕纳米抗体领域，真正做到全球行业领先。国内市场，深圳普瑞金、苏州康宁杰瑞、苏州博生吉、南京传奇生物科技等公司开始探足纳米抗体领域。
参考资料
