【2.7.4】从天然噬菌体展示库中分离的VHH的结构--6DYX

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源自骆驼科（Camelidae）家族独特免疫系统的单结构域抗体（VHH）作为生物技术的有用工具以及潜在的新型治疗方法已获得广泛关注。 在这里，我们报告最初从幼稚的骆驼科动物噬菌体展示库中分离出来的VHH的结构和生物物理特征。 VHH R419的熔点为66°C，被发现是溶液中的单体。 蛋白质在空间群P6522中结晶，通过分子置换将结构解析为1.5Å的分辨率。

  • 该结构揭示了带有CDR环的平坦互补位，可以将其归类为现有的规范环结构。
  • 高表达产量，稳定性和快速结晶的结合可能使R419成为CDR嫁接和同源性建模的候选支架。

一、前言

骆驼科的免疫系统（骆驼，美洲驼和羊驼 camels, llamas and alpacas）除了拥有原型抗体外，其免疫系统也不常见。 它们的血清中含有一种丢失了轻链的抗体[1]。 可以克隆这些骆驼科抗体的可变域，从而产生最小的已知功能性抗原结合单元-VHH（也称为纳米抗体，单域抗体或sdAb，nanobodies, single domain antibodies, or sdAb）。 与传统的抗体片段相比，VHH抗体片段小（13-15 kDa），热稳定，易于在大肠杆菌中产生并且显示出独特的抗原结合特性[2]。 抗原特异性VHH的分离是使用来自骆驼科（Camelidae）免疫接种的噬菌体展示，未使用的免疫库或合成/半合成文库进行的[3]。

编码骆驼科重链抗体的基因与2500万年前的其他有蹄类动物不同，并且进化了序列和结构差异，使其与常规的异二聚体抗体不同[4]。 特别值得注意的是抗原结合互补决定区（CDR）环CDR环的显着差异。 已发现VHH具有异常长的CDR1和CDR3环[5]，而CDR1和CDR2的经典结构经常偏离传统抗体中发现的经典结构[6]。

与传统抗体形式相比，VHH生物物理特性的差异引起了人们对于使用VHH进行治疗，诊断甚至检测环境污染物的兴趣[7-9]。 鉴于VHH潜在的生物技术和生物医学重要性，构建高度精确的同源性模型的能力非常有用。 然而，CDR结构的差异可能使VHH的结构同源性建模具有挑战性[10]。 可用的更多VHH结构将增加建模算法的成功率，以及我们对VHH中存在的结构多样性的理解。

VHH R419最初是从免疫前噬菌体展示文库中分离的，以结合李斯特菌表面抗原Internalin B [11]。 后来发现VHH R419是无功能的，因为它无法结合InlB或抑制体外李斯特菌的侵袭[12]。 在这里，我们报告了VHH R419的结构和生物物理特征，因为它在其他与治疗相关的VHH的同源性建模中具有潜在的未来价值。 R419的高产率，稳定性和易结晶性使其成为用于CDR嫁接的有价值的支架。

二、试验方法

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三、结果与讨论

VHH R419在大肠杆菌中表达量很高（〜5 mg -1培养），并使用单步镍亲和色谱法从大肠杆菌周质中纯化至均一（图1a）。纯化的VHH R419的生物物理表征是结合分析尺寸排阻色谱（SEC）和圆二色谱进行的。从SEC柱洗脱的蛋白质为单个单分散峰，保留体积为14.4 ml（图1b）。为了从SEC数据确定R419的四级结构，从标准曲线计算分子量。出乎意料的是，通过SEC确定的分子量被确定为仅5kDa，是从序列计算的分子量（14.7kDa）的约〜3倍。与R419相似大小的VHH（R326，14.7 kDa）没有显示出这种行为（图1b，保留体积，12 ml，计算分子量12 kDa）。 R419通过SEC色谱柱的快速迁移可能表明结构紧凑和单体构型。

R419的稳定性，可逆折叠和聚集倾向是通过圆二色性（CD）光谱和SEC确定的。通过监测抗体的热诱导变性来测量R419的热稳定性（图1c）。由变性曲线算出熔融温度（Tm）为66℃。这使R419的稳定性很好地位于VHH中典型的Tm范围50–80°C [18]中。在某些骆驼科动物VHH中观察到的标志性生物物理特性之一是加热后可逆的折叠[19]。使用几种方法检查了R419的聚集和重折叠特性。首先，使用CD光谱法追踪R419的重折叠。热变性后（图1c），温度梯度立即反转，样品冷却后重新折叠（图1d）。几乎将整个样品重新折叠，冷却后恢复到原始CD信号的85-90％（图1d）。对于溶液中复性的另一定量评估，将R419加热，并在注入易于分离聚集体的SEC柱上计算冷却后样品的回收率[20]。通过四个实验计算得出回收率达82％（±2％）（图1e）。这些结果表明，R419在可逆折叠和抗聚集性（ reversible folding and aggregation resistance）方面显示出优异的生物物理性能。骆驼科动物的VHH域中的抗聚集性和可逆折叠被认为是该域的标志，可将其与人抗体中的同源VH3域区分开来[19]。然而，最近对70只骆驼和美洲驼VHH的调查发现，聚集抗性和可逆折叠非常罕见，只有1-5％的抗体可逆折叠[21]。有趣的是，R419不包含与VHH的可逆折叠倾向相关的因素，例如通常较长的CDR3环（见下文）或存在非规范的二硫键[21]。

R419是易结晶的VHH。 几天后，在几种情况下，结构良好的菱形晶体会直接出现在机器屏幕中（图2a）。 在总共10个条件下生长出相似的晶体。 这些条件包含PEG 4000或PEG 5000 MME，以及Tris，HEPES和MES缓冲液（pH 6.5–8.5）。 机器屏幕上的晶体衍射到1.5Å的分辨率，并且通过分子置换很容易地解决了结构（表1）。 该结构在不对称单元中包含单个分子，没有主要的无序区域（图2b）。

与传统抗体相关的平坦或凸起互补位（paratope ）形状相反，VHH的互补位区域通常分为平坦或凸起[6]。 R419的对位是平坦的，半径为23Å，处于VHH对位半径的正态分布15–25Å内[6]（图2c）。

R419的CDR环使用标准的规范簇进行分类，如North [22]所述。 CDR 1长13个氨基酸，并位于第4个簇之内（图2b）。虽然13个氨基酸是CDR H1在人类，小鼠以及骆驼科动物中最常见的环长，但是簇4仅在2.6％的羊驼CDR1环，0.8％的骆驼CDR1环中发现[6，22]。 R419的CDR2环长10个氨基酸，并且位于簇2中，这是在骆驼科动物VHH中观察到的最常见的规范结构（图2c）。 CDR3的长度为11个氨基酸，该范围在抗体结构的86％内的7-16个残基的中位环范围内[22]。

在许多方面，VHH R419是“平均” VHH，具有许多骆驼科VHH结构所特有的生物物理和结构特性。这里介绍的结构可能对相似的VHH的同源性建模有用，或者鉴于该蛋白的高表达产量，中等范围的热稳定性，可逆折叠而缺乏明显的聚集和易于结晶，R419可能是CDR支架的有价值的工具，或者作为VHH发现的新型半合成噬菌体展示库的基础。

局限性

  • VHH R419没有直接的治疗或诊断价值，因为它似乎不结合InlB抗原。
  • 我们尚未证明VHH R419是CDR嫁接的宝贵工具。

参考资料

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