【6.2.2】超越CDR移植--抗肌生成抑制素抗体的框架和CDR区的结构指导人源化

抗体是一类重要的生物治疗药物，可为其抗原提供特异性，长半衰期，效应功能相互作用和良好的可制造性。通过互补决定区（CDR）移植到人受体框架上的人源化，部分克服了非人源抗体的免疫原性，其可能是对可开发性的主要限制。然而，CDR区域中外来物质的保留仍然是潜在的免疫原性原因。在这里，我们描述了抗肌生长抑制素抗体的人源化，利用传统CDR移植到人受体框架上的两步法，然后是结构引导的方法，以进一步降低CDR-移植抗体的鼠含量。为了实现这一目标，我们用嵌合体（蛋白质数据库（PDB id 5F3B）和CDR移植的抗肌生长抑制素抗体（PDB id 5F3H）解析了肌肉生长抑制素的共晶结构，使我们能够计算预测结构上重要的CDR残基。以及与抗原显着接触的那些。基于结构的合理设计使得CDR-移植抗体的进一步种系化（germlining），降低抗体的鼠含量而不影响抗原结合。轻链和重链可变区的总体“人性”（humanness）增加。

缩写词：ActRIIB, activin receptor IIB; ADA, Anti-Drug Antibody; CDR, complementarity-determining region; EDL, Extensor digitorum longus; GDF8, growth differentiation factor 8; GDF11, growth differentiation factor 11; HAHA, human anti-human antibody; HAMA, human-anti-mouse-antibody; HSC, Human String Content; KD, dissocia- tion constant; PDB, Protein Databank; RGA, reporter gene assay; RMSD, root mean squared deviation; SDR, specific- ity-determining residues; SPR, surface plasmon resonance; TGF-b, transforming growth factor b

一、前言

生物制剂，特别是抗体，代表了治疗学发展的一个增长趋势，目前在美国和/或欧洲批准了44种抗体生物制剂.抗体提供抗原特异性，以及长血清半衰期和 效应子功能，均由恒定结构域上的特定位点介导。尽管它们具有明显的益处，但一个主要的问题是许多非人源抗体（例如来自小鼠或大鼠）显示出显着的免疫原性反应。 通常，针对鼠抗体的外源（非自身）序列产生强烈的免疫应答（即，形成抗药物抗体（ anti-drug antibodies，ADA）），产生显着的人-抗-小鼠- 抗体（human-anti-mouse-antibody，HAMA）应答 。此外，人们认为，与天然人B细胞抗体的同一性（identity）越高，临床上HAMA反应的风险就越低.

鉴于HAMA与非人序列内容之间的明显联系，解决该免疫原性风险的一种常用方法是通过将互补决定区（CDR）移植到人受体种系框架上，而使小鼠抗体人源化来降低鼠的含量。该方法仅留下具有异种（xenogeneic）残基的CDR。尽管如此，当用人源化抗体治疗时，人抗人抗体（HAHA）反应仍然存在问题。 CDR中仍然存在鼠抗体和HAHA反应，通常与至少部分含有CDR残基的表位相关。因此，为了进一步降低免疫原性的潜在风险，还需要去除CDR中的鼠内容物。这可能是困难的，因为CDR编码抗体：抗原相互作用的结合区域。必须注意保持这些相互作用和环路支持残基。尽管如此，可以实现一些额外的人源化，因为并非CDR区域中的所有残基都是结合所必需的。据推测，CDR内仅有20-33％的残基是抗体与抗原结合所必需的。

目前有几种不同的方法来最小化外来CDR含量，包括在人源化过程中选择降低含量（content）的方法和在CDR移植后除去内容的方法。前一种方法包括仅使用来自特异性决定残基（ specificity-determining residues ，SDR）的鼠残基，即抗体与配体结合所必需的残基，以及多个人种系序列作为模板。“超人源化”使用基于CDR同源性的方法进行抗体人源化，并有效地选择具有与鼠CDR最匹配的CDR的种系。另外一种方法包括筛选种系片段，同时仅移植重链和轻链的CDR3。这种方法也可以与使用体细胞超突变的亲和力优化相结合。最后，免疫相关的抗体人类或 human string content也是一种用于选择人源化抗体的方法。这里，框架片段从多个种系中选择，以使整个可变区更像人类。

在CDR移植后，存在降低剩余非人类内容相关的潜在免疫原性风险的替代方法。 一种方法通过丙氨酸扫描和引导选择的残基突变减少含有CDR的免疫原性表位。同样，CDR修复方法利用CDR位置的软随机化，小心地将文库聚焦于种系氨基酸。最后， 在小鼠和种系CDR之间产生二元取代文库的方法允许产生任何非必需的CDR残基

除了与非人类序列含量相关的免疫原性的潜在风险之外，在选择种系时必须考虑可开发性的额外限制。 诸如稳定性和表达的性质在V基因的特定家族中不同。 来自VH1，VH3和VH5家族的V基因被发现是比其他家族更好的生物治疗候选者。然而，CDR移植到框架子集上并不总是产生稳定的抗体，因为它们之间可能存在某些CDR和框架残基不相容性。 这通常通过框架区域中的突变来补偿以恢复天然小鼠结构对。

在本研究中，我们研究了一种结构指导方法，以降低啮齿动物衍生抗体的潜在免疫原性风险。选择用于人源化的抗体是抗肌生成抑制素小鼠抗体RK35。肌肉生长抑制素（生长分化因子8 / GDF8）是骨骼肌生长的负调节因子，是TGF-b（转化生长因子b）超家族的成员。肌肉生长抑制素的生物学功能是非常保守的，其中小鼠和人类同源物之间存在100％的氨基酸序列同一性。通过突变或敲除导致的肌肉生长抑制素信号传导缺陷导致骨骼肌质量的增加，其中肌肉比正常通过增生和高血压大100-200％，如在包括人类在内的哺乳动物中所见。仅在仅有狗的情况下单个功能性肌肉生长抑制素等位基因，观察到改善的肌肉功能，虽然不像纯合子那样明显增加肌肉质量。药理学上抑制肌肉生长抑制素活性的肌肉中和抗体，突变肌肉生长抑制素肽或甚至诱饵肌肉生长抑制素受体 - 融合蛋白，导致肌肉质量增加和肌肉功能改善。如先前报道，通过杂交瘤技术获得称为RK35的鼠抗体。 RK35通过激活素受体IIB（ActRIIB）中和成熟的肌肉生长抑制素信号传导，并且显示出有希望的体内结果，包括肌肉萎缩减慢和ALS啮齿动物模型中的握力降低。

在这项工作中，我们最初证明了抗肌生成抑制素抗体的成功人源化与传统的CDR移植方法在临床验证的种系框架上。在传统的CDR移植后，我们探索了由共同引导的小鼠CDR含量的进一步减少。 抗体的晶体结构：抗原复合物。 共晶结构使我们能够了解该抗体的表位和互补位，以及模拟CDR的表现和稳定性。 通过合理设计减少抗体的鼠含量是减轻免疫原性可能相关风险的一种方式，同时为治疗用途打开进一步的优化/工程，例如改善稳定性和其他生物物理特性。

二、结果

2.1 通过CDR移植和表征对RK35的进行人源化 Humanization by CDR grafting and characterization of RK35

RK35是一种针对成熟肌球蛋白的小鼠单克隆抗体。 它是由用人肌肉生长抑制素免疫的肌肉生长抑制素敲除小鼠产生的。 该抗体中和肌肉生长抑制素与高亲和力受体ActRIIB的相互作用，如竞争ELISA和基于报告基因细胞的活性测定（RGA）所示，其监测SMAD调节的信号传导途径的激活（表1）。 另外，该抗体增加体内肌肉量（图1）。 还将RK35与参考临床人肌肉生长抑制素抑制剂MYO-029,进行比较，当将嵌合RK35（小鼠可变区与人IgG1恒定区）与MYO-029进行比较时，表明在表面等离子体共振（SPR）分析中结合亲和力增加（ 表格1）。 重要的是，RK35显着增加了趾长伸肌（EDL）肌的最大强直力，横截面积和质量，而用MYO-029治疗的小鼠没有显示任何这些参数的增加（图1）。

由于其在体外和体内模型中与MYO-029相比具有优越的性质，因此选择抗体RK35作为优化候选物。虽然没有进行实验性的体内研究，但众所周知，小鼠来源的单克隆抗体存在HAMA反应的强烈风险。使用Epivax in silico ADA预测工具突出了这一风险，该工具表明基于与具有已知免疫应答的其他23种抗体的比较，小鼠RK35将具有潜在免疫原性的风险（图S1）。选择RK35抗体进行人源化以降低这种潜在风险。框架模板选择基于与接近的人种系序列的序列相似性，以及与临床验证的种系序列的同源性。重链和轻链的CDR分别接枝到VH3和VK1种系上。通过竞争ELISA，RGA和SPR测定，该CDR-移植的重链（VH 1.0）和CDR-移植的轻链（VL 1.0）保持完全活性（表1）。了解肌肉生长抑制素与GDF11（生长分化因子11）的高度同源性，SPR分析用于证实RK35 1.0 / 1.0（VH1.0重链和VL1.0轻链）与重组体的解离常数（KD）成熟GDF11与重组成熟肌肉生长抑制素的KD无统计学差异（结合GDF11的KD为4.7pM）。

2.2 RK35 Fab和成熟肌肉生长抑制素二聚体的共晶结构 Co-crystal structure of RK35 Fab and mature myostatin dimer

为了帮助分析和进一步人源化RK35抗体，获得了RK35嵌合抗体的X-射线晶体结构以及与肌肉生长抑制素复合的人源化形式（RK35 1.0 / 1.0）。 为此，用木瓜蛋白酶处理嵌合和人源化抗体以获得Fab。 将纯化的Fab与重组成熟肌生成抑制素二聚体复合，并筛选晶体形成。 对于人源化和嵌合RK35，获得Fab：肌肉生长抑制素复合物的晶体。 将人源化复合物拆分为2.70A（蛋白质数据库（PDB）id 5F3H），并使用X射线晶体学将嵌合鼠复合物分离至1.76A（PDB id 5F3B）（参见方法和表2）。

与嵌合Fab或人源化1.0 / 1.0Fab复合的成熟肌肉生长抑制素的两种晶体结构显示2个Fabs与每种肌肉生长抑制素二聚体相互作用（图2）。这种2：2复合物在chimera的单位细胞中有一个拷贝，在人源化中有2个拷贝。每个Fab在肌肉生长抑制素单体之一的末端相互作用，并且仅与二聚体中的2个肌肉生长抑制素链中的一个接触。值得注意的是，肌肉生长抑制素二聚体的结构与先前报道的结构明显不同，并且未显示其他肌肉生长抑制素结构或密切相关的TGF-b家族成员的典型蝴蝶结构.有2种晶体结构PDB在肌肉生长抑制素区域具有100％的序列同一性。这些是3hh2，含有与卵泡抑素288,和3sek复合的肌肉生长抑制素二聚体，其含有与卵泡抑素样3复合物复合的肌肉生长抑制素单体.观察肌肉生长抑制素单体从3hh2,3sek的排列，人源化结构和嵌合结构（图3a），我们看到肌肉生长抑制素的大多数b链“手指”区域排列良好，但被确定为“前螺旋”(Pre-helix)区域的区域发生了大的变化。和“手腕 - 螺旋”(Wrist-helix”)区域。当将3hh2中的二聚体与嵌合结构进行比较时，这导致二聚体形成的大的变化（图3b-d）。当一个单体用于比对时，由于腕 - 螺旋的重新定位，另一个单体看起来与完全不同的构象结合，尽管我们看到来自链2的每个二聚体的腕螺旋在大致相同的位置停靠进入连锁店。这种结构的重新定位改变了先前为myostatin和其他TGF-b家族蛋白（图3d）报道的蝴蝶样二聚体与更线性二聚体（图3c）的一致性。对这些肌肉生长抑制素结构和几种其他TGF-b家族蛋白的分析表明，前螺旋/腕部螺旋区域的灵活性可以使这种与不同结合配偶体和晶体环境相关的构象发生变化（参见补充结果，图S2）。和S3和表S1）。

嵌合结构用于确定与肌肉生长抑制素上的结合表位（<5.0 A）接触的CDR中的残基，并且与RK35 1.0 / 1.0共晶结构交叉参照（图4a-b） 。这些列表可以在补充表2中找到。此外，该结构为我们提供了关于直接CDR移植方法易于人源化的更多信息。这是通过观察人与鼠可变结构域的结构相似性来完成的，特别是在CDR区中（图4c）。比较了几种组分的Ca-均方差（RMSD），包括整个Fab，可变区，可变框架和每个单独的CDR。总体相似性非常高，Fab之间仅有0.88 A偏差，可变域为0.54 A，可变重量为0.40 A，可变光为0.56 A，框架为0.56 A，0.32-0.76 A为CDRs。这与比较同一蛋白质的多种晶体结构时的预期差别不大，平均变异约为0.3 A

2.3 表位重叠 Epitope overlap

在体内，肌肉生长抑制素与ActRIIB和共同受体结合，导致SMAD途径的激活.从RGA测定中，我们可以看出RK35能够阻断肌肉生长抑制素激活该途径（表1）。为了进一步研究RK35的生物学功能，我们想确定它是否能够直接阻断肌肉生长抑制素表面上ActRIIB的表位。为此，我们的目标是产生ActRIIB的同源模型：肌肉生长抑制素复合物。除肌肉生长抑制素外，还有许多其他TGF-b家族成员通过ActRIIB受体发出信号，包括激活素A，BMP-2，BMP-6，BMP-7，BMP-9，GDF-5，GDF-11，抑制素A，抑制素B和节点.其中，有几种可用的复合晶体结构，显示ActRIIB与激活素A， BMP-2,和BMP-9的指状区结合的保守结合模式。分析可用的结构数据，显示与ActRIIB的保守结合模式，这些同源物与肌生成抑制素的预测结合界面的序列同源性，相似的结合亲和力，以及与ActRIIB突变相关的亲和力的相关变化预测在结合之间表明，肌肉生长抑制素应与ActRIIB结合，其结合方式与其他TGF-b家族成员相同（参见补充结果和图S3和S4）。因此，可用的复杂结构应提供合理的模板以生成同源模型。

用于产生同源性模型复合物的模板结构是ActRIIB：激活素A复合物（1nyu）。为了产生同源性模型，来自人RK35：肌肉生长抑制素复合物的肌肉生长抑制素在结构上与激活素结合。晶体结构1nyu的结构域。使用该ActRIIB：肌肉生长抑制素模型和人RK35：肌肉生长抑制素晶体结构，结合表位被确定为肌肉生长抑制素上的残基，其在各自的结合配偶体的5.0A内。 RK35的表位含有17个残基，ActRIIB含有19个残基（参见补充表3）。在ActRIIB上的这些残基中，其中11个（58％）与RK35上的结合表位重叠（参见图5）。表位的这种大的重叠表明RK35抗体的功能将直接与肌动蛋白抑制素上的相同结合贴片上的ActRIIB竞争并抑制SMAD途径的活化。此外，由于表位的核心重叠，因此ActRIIB不能在不首先去除RK35的情况下结合肌肉生长抑制素。

2.4 通过CDR的种系进一步减少鼠的含量 Further reduction of murine content by germlining of CDRs

为了进一步人源化抗体，我们首先想确定哪些残基可以突变为人种系。 这是使用晶体结构接触进行的，以及结合亲和力和突变稳定性变化的计算预测。 对于重链，CDR-H1与种系相同，因此仅检查CDR-H2和CDR-H3的。 对于轻链，检查所有3个CDR对种系的潜在突变。

RK35-VH1.0的CDR-H2区域定义为Kabat位置H50至H65，并且与人种系的比对显示在图6中。从该区段，10个残基是保守的，7个残基不是。我们观察了突变对从RK35-VH1.0序列到人种系序列的7个非保守残基中的每一个的影响。

首先，使用Discovery Studio中的稳定性预测算法确定突变稳定性的变化。结果如表3所示。在该方法中，> 0.5kcal / mol的变化被归类为显着变化。位点50,52a，55和60均显示突变后稳定性丧失，位点53和56显示稳定性没有显着变化，位点58显示突变后稳定性增加。

接下来，我们使用方法部分中描述的3种不同方法（Discovery Studio，MacroModel和Prime）研究了突变时结合亲和力的变化。对于Discovery Studio方法，> 0.5 kcal / mol的变化被归类为显着变化。其他2种方法需要> 1.0kcal / mol的较大变化才能归类为显着。这些计算的结果显示在表3中。对于位点50，Thr至Ala突变显示与包装相互作用中的一些损失相关的结合亲和力的丧失，如仅通过Prime方法所建议的。对于位点52a，预测Ser至Gly突变通过所有方法是中性的，显示出填充相互作用的一些损失，但是通过静电能的降低来弥补。通过所有方法预测两个位点53（Gly至Ser）和60（Pro至Ala）均为中性，并且根本不显示强相互作用。如Prime方法所预测的，位点55是唯一预测具有结合亲和力显着增加的那一个。该方法表明，突变具有溶剂化能量的降低而没有包装损失。最后，通过所有3种方法预测突变位点56（Tyr至Ser）和58（Ser至Tyr）以降低亲和力。对于位点56，这种突变失去了强烈的堆积相互作用，而这种相互作用不能通过其不利的静电能量的减少得到补偿，而58位Ser到Tyr的突变产生了大的空间碰撞，这是通过最小化无法克服的。

在7种可能的突变中，仅预测G53S突变不会降低稳定性或结合亲和力，这表明这将是最安全的突变。 观察到三个突变（S52aG，S55G和P60A）具有小的稳定性降低，其中结合亲和力没有变化或略有增加，第四个（T50A）具有稳定性和结合亲和力的轻微降低。 预测表明这些可以突变，而不会对结合或稳定性产生很大影响。 预测最终的2个突变（Y56S和S58Y）会大大降低结合亲和力，应该避免。

没有CDR-H3与种系的直接比对，但检查了Kabat位置H99和H101的可能突变以使突变成更常见的人类残基。 模拟的突变是M99F和N101D。 在这里，预测M99F略微稳定，但3种方法中的任何一种都没有显示出结合亲和力的大的变化。 对于N100D，预测该突变会降低2种方法的亲和力，因为它会干扰H96处的Asp，其与肌肉生长抑制素形成盐桥。

VL的CDR中存在14种可能的突变，其在种系和VL1.0之间是不同的。 我们进行了与H2和H3环相同的分析，以确定哪些种系突变会影响结合，哪些可以耐受。 结果显示在表3中。由此，我们预测这些位点中的11个可以突变为种系而对结合没有任何影响（L24，L28，L29，L31，L33，L34，L50，L53，L54， L55和L56）。 其中，预测Ser至Ala的L50突变是中性的，但确实改变了结合相互作用的类型。 在这里它用疏水性填料取代了与肌 - 他汀的氢键。 预测只有一个突变对结合具有小的影响（L91），预测2个突变会大大降低结合（L32和L96）。

2.5 预测的CDR突变的实验验证 Experimental validation of predicted CDR mutations

在CDR移植后表达良好且功能完全的RK35 VH1.0 / VL1.0（表1）用作起点，以通过减少CDR中的鼠的内容来进一步人源化该抗体。可变轻链和可变重链。最初，我们试图将完整的人种系残基引入CDRH2和CDRL2。这些结构分别被命名为RK35 VH 1.2和RK35 VL 1.2。氨基酸序列比对显示在图6中。对于制备的所有变体，使用定量条件培养基（在方法部分中描述）来评估竞争ELISA中的结合活性。如果条件培养基在ELISA中没有显示任何活性，则构建体不进行纯化和进一步分析。纯化RK35 VH 1.0 / VL 1.2，并使用纯化的材料证实，通过竞争ELISA，Biacore KD或RGA（表1）测量，确实生长的VL2不会导致活性丧失。这与没有种系突变应该降低结合亲和力的预测很好地相关。重链CDR-H2种系构建体RK35 VH1.2 / VL 1.0在条件培养基中未显示任何活性，这也对应于预测存在可显着降低结合亲和力的若干突变。

对于轻链，我们继续进一步种系构建体，因为最初的CDR-L2种系成功。在计算预测和在晶体结构中观察到的成熟肌肉生长抑制素的RK35 CDR接触的指导下，设计了构建体RK35VL1.3和VL1.4。在这里，两种构建体进一步种系未预测会降低亲和力的CDR-L1和CDR-L3残基。这包括5个CDR-L1突变和一个CDR-L3突变。 2的唯一区别是L50位置是VL1.3的鼠残基和VL1.4的种系。这样做是因为该残基与晶体结构接触并且可以改变结合相互作用的类型。两种构建体的结合亲和力几乎没有变化（表1）。 VL1.4构建体保留了除3个鼠残基外的所有残基。其中一个未与种系对齐，预计2个会降低结合亲和力。最后，设计RK35 VL 1.5以试图进一步使构建体种系化。这与VL 1.3相同但突变了W96L。然而，如预测的，RK35 VH 1.0 / VL 1.5显示通过ELISA和Biacore降低的结合活性，并且在RGA中完全丧失中和活性（表1）。该Trp在界面处形成大的疏水接触，并且突变为Leu去除了大量预测的范德华相互作用。

初始VH1.2构建体完全细胞化CDR-H2并且不保留任何活性。 如果共晶体结构表明残基与成熟肌肉生长抑制素直接接触，则新构建体VH 1.3仅保留鼠氨基酸。 CDR-H2中未显示在CDR中直接接触的剩余残基被种系化（图6）。 同样，该构造不保留任何活动。 这很可能部分归因于H56突变。 虽然小鼠的血清没有直接接触，但Tyr的变异预示着会发生冲突。

对于CDR-H2，下一组构建体更为保守。 RK35 VH 1.4在M99F和N101D位置含有取代，RK35 VH 1.5在CDR-H2中仅具有取代G53S。 之前尝试改变CDR-H2导致严重的活性丧失，因为CDR-H2与肌肉生长抑制素产生许多重要的接触。 与RK35 1.0 / 1.0相比，纯化的RK35 VH 1.4 / VL 1.0在竞争ELISA中显示出活性降低1.71倍，在RGA测定中显示7.5倍。 这与Biacore看到的KD降低相关。 RK35 VH 1.5 / VL 1.0通过ELISA，Biacore和RGA显示保留的活性（表1）并且与基于结构建模的预测相关（表3）。

最后，我们想测试这些重链和轻链突变体是否可以组合使用。 RK35 VH1.5 / VL1.0和RK35 VH1.0 / VL1.4是具有最多种系突变的完全活性的重链和轻链突变体。 为了确定这两种突变体的活性是否在组合时保留，我们产生了组合克隆RK35 VH1.5 / VL1.4。 该组合通过ELISA，Bia-core和RGA显示保留的活性（表1）。

2.6 RK35构建体的生物物理表征 Biophysical characterization of RK35 constructs

除功能外，重要的是监测抗体的生物物理特性，因为这些特性可以指示可制造性，从而影响药物作为治疗剂的潜力。 上述重链和轻链突变体具有测量的热稳定性和pH稳定性（补充表4）。 所有蛋白质的展开开始T1％均高于50℃的阈值，尽管可以看出RK35 VH1.0 / VL1.0比其他人源化变体更稳定。 pH稳定性测定的变化相对较小，尽管版本RK35 VH1.0 / VL1.0也是最稳定的。

2.7 Increased humanness

在这项工作中，我们引入了种系突变，根据非人类序列内容与免疫反应的已知相关性，减少CDR中非人类序列的含量。比较CDR移植的RK35 VH1.0通过体外分析（RK35 VL 1.4和RK35 VH 1.5）具有保留活性最少的鼠内容物的克隆的/VL1.0，我们能够去除28个非种系残基中的11个。为了进一步证明免疫原性风险的潜在降低，我们使用了Lazar等人方法，量化抗体序列中潜在的MHC / T细胞表位水平，以确定抗体序列的“人类。此处，人类定义为抗体中肽链的比例。在人类种系序列中发现。我们通过这种方法计算了两种不同的增加人性的指标：完美9聚体（可在人种系中发现的9聚体）的数量和人体细胞系含量（HSC）评分。为了验证与种系序列的相似性是否与降低的免疫原性相关，我们分析了43种具有报告的免疫原性的临床抗体的数据集。由此我们可以看到9-mer的数量和HSC得分在事实显示与免疫原性降低显着相关。 （表S5和图S5）。然后，我们评估了HSC和9聚体评分以及我们设计序列的序列同一性百分比和序列相似性百分比（表4）。可以看出，RK35 VH1.0和RK35 VL1.0克隆大大增加了它们的HSC评分和完整的9聚体在嵌合体上的数量。然而令人惊讶的是，重链显示出对轻链的人性增加，这与人源化抗体通常观察到的相反.60然而，在这种情况下，抗体具有相对短的7个氨基酸长的CDR-H3，（80）鼠CDR的百分比长于7个氨基酸61并且具有已经与人种系匹配的CDR-H1。进一步优化的克隆RK35 VL 1.4和RK35 VH 1.5的HSC评分分别为96和91。这些从重链和轻链CDR移植评分（90和89）以及原始鼠构建体（87和79）增加。此外，从小鼠到CDR移植到进一步优化的构建体大大减少了这些构建体表面上存在的非人序列内容物的量（图7）。

可以更广泛地定义humanness的定义，以比较序列与整个人类库中的抗体的相似性。我们使用该定义与Gao等人描述的T20人性计算器评估这些序列的humanness。 已显示与一组相似的临床抗体的免疫原性相关。在这里，我们发现T20结果的排名与人类的9-mer和HSC评分种系定义一致（表4）。 因此，通过任一定义，这些突变体具有增加的humanness。

我们更深入地检查了CDR区域，因为已经证明它们是人源化抗体中免疫应答的重要原因。在这里，我们计算了包含一个或多个CDR的每个CDR周围的序列区域的HSC和Perfect 9mers（表5）。 人类的大部分增加见于轻链CDR，其中，在克隆VL1.4中，L2中的突变除去所有非人序列内容，并且L1和L3人类大大增加。 对于CDR-L1，19个潜在的9聚体表位中的另外8个与人类种系相匹配，而在CDR-L3中，另外9个聚合物是9个种系的种系。 对于重链，CDR-H1在CDR移植形式中完全生长，并且仅去除少量非人类内容物。 这是由CDR-H2的HSC评分的小幅整体增加所致。

2.8 评估预测方法 Evaluation of prediction methods

如上所述，我们利用计算方法成功识别耐受的CDR突变以增强RK35的人性，同时保持稳定性和亲和力。基于此，我们希望评估该方法对更广泛数据集的预期预测能力，并更好地理解其超出此单一示例的一般效用。该方法的设计目标是区分将使抗体不稳定的突变与中性或稳定的突变，并区分那些会降低亲和力的突变和那些维持或增加亲和力的突变。为了理解这些方法在这种分类中的表现，我们评估了所有3种亲和力预测方法和单一稳定性方法对实验确定的具有相应X射线晶体结构的突变DDG的较大数据集。对于亲和力测量，我们使用AbBind，一个包含> 1000抗体：抗原相互作用的大型数据集。为了确定每种方法的预测能力，我们计算了它们在正确识别亲和力降低突变（DDG> D1.0 kcal / mol）时的表现。这类似于确定关键界面残基的热点预测.我们在此数据集上生成Prime和MacroModel方法的DDG预测，并使用之前确定的Discovery Studio方法利用预测。这些DDG预测的结果在补充表6中显示了这些预测。我们分析了这些预测，了解每种方法如何识别亲和力降低突变，以及方法组合是否增加了预测性能。该分析的结果显示在表6中。我们使用与上述相同的预测截止值。对于Discovery Studio，预计> 0.5kcal是亲和力降低，而Prime和MacroModel> 1.0 kcal / mol。低于此截止值的那些被定义为耐受。对于个体预测，Discovery Studio能够正确分类62％的亲和力降低突变和78％的耐受突变，Prime能够正确分类49％的亲和力降低突变和79％的耐受突变，以及MacroModel能够正确分类50％的亲和力降低突变和86％的耐受突变。此外，我们研究了3种方法的预测准确性，通过预测的亲和力降低突变的百分比来衡量，这些突变也是实验性的亲和力降低。对于Discovry Studio，Prime和MacroModel，这些分别为64％，59％和69％。耐受突变的相同预测准确度分别为77％，71％和73％。

除了单独检查方法外，我们还研究了综合效应是否具有更强的预测能力。 事实确实如此，因为当两种或更多种方法达成一致时，他们准确地预测了70％的时间内亲和力减少突变和75％的时间耐受突变。 此外，当所有3种方法达成一致时，这种准确度分别提高到80％和82％。 这使我们能够更好地理解为什么RK35突变体的预测准确性相当高，因为23个突变中的16个属于组合的略微有利/中性组（均被预测为耐受），23个中有2个属于非常不利的组（均为 预测为亲和力减少）（参见补充结果进一步分析个体突变的亲和力预测）。

对于稳定性测量，我们无法识别与AbBind相似的包含抗体特异性突变的数据库，因此我们使用可用的实验稳定性数据和晶体结构评估了来自35种不同蛋白质类型的> 1000个突变的大型数据集。我们预测了这一变化使用Discovery Studio方法对此数据集的稳定性（补充表7）。如前所述，我们将不稳定突变定义为具有实验性DDG> D 1.0 kcal / mol的那些。我们在这里使用与绑定亲和力数据集相同类型的分析，但只使用单个Discovery Studio方法（表7）。在这里，预测截止值为0.5 kcal / mol，以将不稳定与耐受突变分开。对于稳定性突变，Discovery Studio能够正确分类85％的不稳定突变和48％的耐受突变。预测不稳定突变的准确性为67％，预测耐受突变的准确率为72％。稳定性测量的分类和准确性与亲和力相似，但只有一种方法可以作为分类的基础，设计突变体的预期性能会有所降低（参见补充结果进一步分析稳定性预测）。

三、讨论

在这项工作中，我们描述了用于减少框架和CDR区中的非人序列内容的抗体人源化方法。通过CDR移植到人种系上的人源化的初始步骤经常需要一个或多个回复突变来恢复活性。然而，在人源化RK35的情况下，不需要回复突变。鉴于嵌合和CDR-移植变体之间的相似性，该抗体易于人源化并不过分令人惊讶。先前已经描述了几种人源化鼠抗体的方法，证明了经常被鉴定为维持CDR环构象的位点列表。人源化和鼠RK35之间可变结构域不同的位点，McCafferty等人仅包括H94和L48位置作为残基对于经典构象是重要的。 R_H94_K和I_L48_L突变都非常保守。此外，2个残基H49和L48是Vernier区的一部分。这些位点被描述为CDR正下方的残基。 L48具有如上所述的保守突变，并且H49也是具有S_H49_A突变的小变化。通过这些方法未将所有其他突变鉴定为对人源化至关重要。在这种情况下，使嵌合和人源化晶体结构可用于理解人源化过程有点独特。鉴于两种结构的相似性，人源化如此直接的原因就越明显。在两种构建体之间，CDR位置几乎是相同的，特别是与肌肉生长抑制素接触的残基。因此，H94，L48和H49位置的保守差异不会显着改变结构，因此不需要进行反向突变。

获得共晶结构以确定形成抗体互补位的CDR中的氨基酸的能力，允许合理设计方法进一步人源化和优化RK35抗体。在大多数情况下，我们准确地预测了哪些突变是可以容忍的，哪些突变是不利的。当不同的预测方法达成一致时，亲和力预测的置信度会增加，而当它们不同时，它们的置信度会降低。预测的DDG的差异与力场，溶剂化模型，侧链放置和最小化方面的每个单独方法的构造相关。正如之前所报道的那样，个体评分函数在不同类型的预测上表现不同。尽管预测方法不同，但这些方法似乎有些互补，因为当所有3个预测方法相同时，预测能力会增强。基于方法一致性的这种增强可能是由于多种因素的组合，包括更容易分类的残基位置的识别以及与任何特定方法中的不准确偏差无关的那些。

除CDR移植后抗体中异种含量的减少增加了进入临床前降低免疫原性风险的可信度。在临床前评估免疫原性期间，这种风险的实验性分析可以通过几种方式进行，包括使用T细胞增殖试验。这些测定使用健康的供体外周血单核细胞来研究感兴趣的药物或来自药物的特定肽是否呈递给T细胞并导致那些T细胞的增殖。这些方法最适合用作指示诱导免疫应答的风险，而不是确定哪种肽会诱导免疫应答的方法。然而，目前，这些检测方法在技术上和临床上都没有得到验证，因此不能作为患者预期免疫反应的可靠预测因素。如果没有这种经过验证的临床前模型，将人性（humanness）作为一种度量标准，在这里和文献中证明与免疫原性降低相关，使我们对降低这种潜在的免疫原性风险有了进一步的信心。然而，最终评估需要对这些抗体进行临床验证。

目前关于进一步种植CDR嫁接的RK35抗体的工作是另一个证明，并非CDR中的所有残基都不是保留抗原结合所必需的，从而进一步优化了与非人类序列含量，稳定性和其他生物物理特性相关的潜在免疫原性风险可能。在不知道抗体：抗原复合晶体结构的情况下，这种通过耐受种系残基的突变去除鼠内容物的方法是可能的。这可以通过实验筛选和选择方法来完成，如Townson等人所述。那里他们描述了在二元选择文库中使用种系取代进行噬菌体展示的方法。从它们对3种不同抗体的CDR种系中，它们能够从CDR移植后留下的CDR H1，H2，L1，L2和L3中去除32至53％的非人残基（总共11至16个残基）。这些结果类似于此处描述的方法中去除的内容，其中我们能够去除50％的非人序列内容（11个残基）。去除的小鼠含量的确切量无疑会因抗体和与抗原相互作用的性质而有所不同，但每种方法在减少潜在免疫原性残基方面都有类似的成功。

在这里描述的方法中，成功地解决了X射线结构，但是通常这有时是一个劳动密集且耗时的过程，并且一些抗原或抗体：抗原复合物可能不适合结晶。尽管有前期资源，但与实验筛选相比，整体设计过程快速而直接，只需预测23种不同的突变，并产生10种不同的抗体结构。这导致去除与噬菌体展示实验中相似量的序列内容。因此，当X射线结构可用时，该方法将是降低与非人类序列内容相关的潜在免疫原性风险的有效方法。此外，解析的晶体结构的效用不限于种系序列的优化。计算机优化可用于成功开发所需的许多其他抗体特性。诸如粘度，聚集倾向，化学不稳定性，相分离和降低的清除率等性质受益于用于直接预测的共晶结构，以及防止引入去稳定化和亲和力降低突变。另外，如前所述，确定相互作用的表位可用于理解抗体的生物活性和功能。鉴于所有这些益处，确定抗体：抗原复合物的晶体结构通常是独立于CDR残基的种系优化而进行的活性。因此，可以充分保证以最少的额外资源利用这种努力的方法。

鉴于临床患者的剂量，疾病和同种异型耐受性的多样性，预测免疫原性仍然是该领域正在努力的复杂目标。 虽然继续探索计算机和其他免疫原性预测方法，但人们普遍认为抗体异种含量的减少将提高低免疫原性的可能性。 在这项工作中，我们展示了一种直接的方法，可以用最少量的筛选结构显着降低抗体的非人类序列含量。 这应该可以减少作为生物治疗药物开发抗体的潜在免疫原性风险。

四、材料与方法

4.1 细胞培养表达和纯化 Cell culture expression and purification

略

4.2 RK35和肌肉生长抑制素复合物的结晶 Crystallization of the RK35 and myostatin complex

用固定的木瓜蛋白酶裂解嵌合RK35约16小时。切割后，使用一次性柱除去木瓜蛋白酶。将消化的抗体片段透析至低盐缓冲液，并使用HiTrap SP离子交换柱分离Fab和Fc组分。随后将Fab交换至含有2％CHAPS的标准肌肉生长抑制素结合缓冲液，并加入肌肉生长抑制素至终浓度为1：2.25Fab。随后将该复合物装载到Superdex 200上浆柱中。纯化嵌合RK35 Fab和肌肉生长抑制素，并将蛋白质复合物在50mM tris盐酸盐pH 7.5和100mM氯化钠的缓冲液中浓缩至10.75mg / ml。使用悬滴法在18℃下相对于含有20％PEG MME 5000和100mM bis-tris pH 6.5的溶液获得晶体。

除了将蛋白质溶液与含有20％PEG 3350和200mM氯化钠的无缓冲溶液平衡外，以类似方式获得含有人源化RK35 Fab和肌肉生长抑制素的晶体。

4.3 数据收集和改进 Data collection and refinement

在光束线22-ID（东南区域协作访问团队，SER-CAT）处收集每个晶体的单波长（1.0A）数据。 每个数据集使用冷却至-180℃的单晶。 使用HK2000程序进行数据处理

使用程序AMORE通过分子置换解决了与肌 - 他汀复合的嵌合RK35的结构。用于分子置换搜索的探针是PDB entry 1HZH。 在细化之前，随机选择5％的数据并指定为Rfree测试集以监控细化的进度。 使用Coot 的迭代循环重建蛋白质模型，随后用Buster进行细化。一旦重建RK35，将PDB条目3HH2中发现的肌肉生长抑制素的坐标手动置于不同密度。 使用Coot重建模型的其他周期随后使用Buster进行细化，得到了具有良好几何和统计结构的结构（表2）。

使用嵌合RK35和肌肉生长抑制素复合物的结构作为探针，通过分子置换解决了与肌球蛋白复合物的人源化RK35的结构。 使用Coot的迭代循环重建人源化RK35分子，使用Buster进行精细化，产生具有良好几何结构和统计学的结构（表2）。

4.4 分子建模的结构准备 Structure preparation for molecular modeling

用于这组计算的X射线晶体结构是嵌合体RK35加肌肉生长抑制素，其分辨率为1.76A。该结构每单位细胞含有6个蛋白质链，对应于2个轻链（B和F）， 2条重链（A和E）和2条肌肉生长抑制素链（C和D）。对于输入结构，只有链A和B用于稳定性计算，链A，B，C和D用于结合亲和力计算。它们分别代表单个Fab二聚体和Fab二聚体/肌肉生长抑制素二聚体复合物。为了准备不同计算方法的结构，使用了2种不同的制备方法。首先，通过将Discovry Studio 3.0（Accelrys Inc.）的“Prepare Protein”协议应用于具有默认参数和CHARMPLR forcefield的稳定性和结合亲和力输入结构来构建dsv格式化结构。接下来，使用具有默认参数的Schrodinger 2010软件套件（Schr€odinger LLC）的“预备”脚本和OPLS2005力场，从结合亲和力结构制备mae格式化结构。

4.5 计算突变时的稳定性变化 Calculation of change in stability upon mutation

通过将Discovery Studio 3.0的“计算突变能量（稳定性）”方案应用于dsv格式的Fab二聚体结构来计算突变时稳定性的变化。 使用默认参数，但非极性表面系数除外，其设置为0.007。

4.6 计算突变时结合亲和力的变化 Calculation of change in binding affinity upon mutation

使用Fab二聚体/肌生成抑制素二聚体复合物，使用三种不同的方法计算突变时结合亲和力的变化。

Discovery studio 方法

通过将Discovery Studio 3.0的“Calculate Mutation Energy（Binding）”协议应用于dsv格式化结构来计算突变时结合亲和力的变化。 使用默认参数，但非极性表面系数除外，其设置为0.007。 配体定义为C和D链。

MacroModel method

通过使用运行来自Schr€odinger 2010的MacroMo-del包的不同组件的脚本来计算对突变的结合亲和力的变化。该方法的方法是使感兴趣的残基突变，然后使用最小化侧链构象。 所选侧链的蒙特卡罗搜索算法与局部连续结构能量最小化的组合，包括选定的侧链和局部结构环境。 该方法使用了OPLS2005力场。 通过将该方法应用于具有链A，B，C和D的mae结构（结合状态），然后是仅包含链ACB和CCD（未结合状态）的2种状态来计算结合亲和力。 结合能是束缚态和未束缚态之和之间的差异。 通过获取结合能的差异来计算结合亲和力对突变的变化。

Prime方法

使用来自Schr€odingerr 2010的Prime包的不同组分的脚本计算突变时结合亲和力的变化。该方法的方法是使感兴趣的残基突变，然后使用包括目标侧链和其他局部侧链的离散侧链搜索算法最小化侧链构象。 该方法使用了OPLS2005力场。 通过将该方法应用于mae结构来定义结合亲和力，其中链A，B，C和D存在（结合状态），接着是仅包含链ACB和CCD（未结合状态）的2种状态。 结合能是束缚态和未束缚态之间的差异。 通过获取结合能的差异来计算对突变的结合亲和力的变化。

4.7 Total human IgG ELISA

。。。

4.8 Competition ELISA and RGA cell based activity assay

。。。

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参考资料

• Beyond CDR-grafting: Structure-guided humanization of framework and CDR regions of an anti-myostatin antibody . https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5058614/ . MABS 2016, VOL. 8, NO. 7, 1302–1318 http://dx.doi.org/10.1080/19420862.2016.1215786