【3.1.3】肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）-TCR工程改造
TILs（Tumor Infiltrating Lymphocytes）是肿瘤微环境中识别肿瘤相关抗原的T细胞。
肿瘤相关抗原的发现是TILs研究的基础。1991年van derBruggen等人发现了第一个肿瘤相关抗原，黑色素瘤相关抗原1（melanoma-associated antigen 1 ，MAGE-1)（文献1）。之后，一系列肿瘤相关抗原，肿瘤特异性抗原被鉴定。
2007年使用黑色素瘤相关抗原MART-1特异性TILs治疗的肿瘤病人，比非特异性TILs治疗的病人，中位生存时间提高15倍（文献2）。
下表举例常见的肿瘤相关抗原
CTA：癌-睾丸抗原，天然存在于胚胎发育的组织，滋养层细胞，胎盘等，也被称之为Universal的肿瘤抗原。
表达调控异常的抗原：在肿瘤高表达，或者发生了突变。但是在正常组织也有表达。突变产生的新抗原，也称之为肿瘤新生抗原。
最理想的作为靶点抗原，只在肿瘤表达而不表达于正常组织。如果在正常组织表达，最大的安全隐患是“on-target,off-tumor”
一、TCR工程改造
1.1 肿瘤特异性TCR筛选
T细胞的抗原特异性，由TCR决定。TCR是由α和β链组成的异二聚体，和CD3组成复合物，并通过CD3的胞内段传导T细胞活化的信号。
筛选TAA特异性T细胞：使用负载特异性TAA的APC细胞筛选，或者使用TAA的转基因小鼠，筛选带有可与TAA结合TCR的T细胞。
鉴定肿瘤特异性TCR的α链和β链，然后将α和β链基因转入细胞，看是否能够重组出特异性结合TAA的TCR。 最初Cole将基因转入Jurkat细胞（一种T细胞系），发现重组的TCR可以识别TAA多肽，但是不能识别黑色素瘤细胞系上的TAA（文献3）。之后Clay使用外周血来源的T细胞，则重组的TCR既可以结合TAA，也可以识别黑色素瘤细胞。
1.2 亲和力增强
过继细胞治疗中使用的TCR多是MHC-I类分子限制性的，经典理论CD8细胞是需要的（MHC-I类分子识别CD8T TCR, MHC-II类分子识别CD4T TCR）。 但是现在很多研究组结果显示，MHC-I限制性的CD4T TCR，并不需要CD8T细胞存在。换句话说，天然情况下，TCR和MHC是低亲和力的，所以需要CD4T和CD8T与MHC分子的匹配。如果MHC-1和TCR是高亲和力结合则无需依赖CD8T细胞，MHC-1类分子可以和CD4T细胞TCR结合（文献5）。
自然情况下，因为阴性选择，高亲和力的TCR非常少。所以可以通过基因修饰，产生高亲和力的TCR。 常用的方法是：单个或者几个氨基酸的替换，TCR的CDR区和肿瘤抗原的亲和力就可以极大提高（文献6）。美国国家癌症研究所2011年，使用靶向NY-ESO-1基因修饰TCR（CDR区两个氨基酸替换）治疗转移性黑色素瘤和转移性滑膜细胞肉瘤，11个黑色素瘤病人，5个发生客观应答（OR），6个转移性滑膜细胞肉瘤则4个发生OR。（文献7）
除了积极的临床结果，也有一些负面的报道。基因修饰的TCR（靶向MAGE-A3/A9/A12）治疗转移性黑色素瘤，9个病人2个发生了致命性神经副作用，原因脱靶结合存在于大脑的MAGE-A12，典型的“on-target, off-tumor”副作用（文献8）
后续又发现靶向MAGE-A3的基因修饰TCR的TILs治疗黑色素瘤等，结果2个病人因为急性心脏衰竭发生死亡。后来发现是和心脏的titin蛋白发生了交叉反应，这种事“off-target，off-tumor”（文献9）。
1.3 载体设计
现在最多使用的是整合基因组的病毒载体(逆转录病毒和慢病毒系统)，也有尝试腺病毒和痘病毒。
图片源于文献10
1990年Rosenberg使用逆转录病毒修饰TCR的TILs治疗晚期黑色素瘤（文献11）。
逆转录病毒将α和β链基因整合入基因组中，转染细胞会表达多拷贝的α和β链（转导拷贝和内源性拷贝）。当内源性和转导的α链和β链组成异二聚体TCR时，不但起不到增强和TAA亲和的作用，而且这种异常表达的蛋白质，可能引起机体的免疫反应，导致自身免疫性疾病的发生（文献12）。
转导TCR α链和β链配对表达策略
- 密码子优化，改变基因序列，增加翻译效率，不改变蛋白质序列的情况下，增加转导α和β链成对表达，也被证实可以增加对肿瘤的识别。TCR胞外区的亮氨酸残基，导致在α和β之间形成二硫键，增加潜在的配对可能性。在α和β链加上亮氨酸拉链，导致coiled-coil形成，增加亚基之间的结合。 （文献13）
- 将小鼠的CDR区加入TCR，导致小鼠-人嵌合体TCR高表达，证实可以增加T细胞功能，且增加CD3结合稳定性。
- 为了彻底克服错配的问题，Voss发明了单链TCR，融合了α链和β链可变区和恒定区。（文献14）
- 为了防止TCR错配，另外一种方式是将内源性的TCR敲除，如使用siRNA,TALENs,CRISPR等。
Foley等比较了不同TCR优化方式，小鼠-人嵌合体TCR，亮氨酸拉链，可以更显著的增加表面TCR表达和增加细胞因子产生（文献15）。
1.4 细胞因子和肿瘤微环境
在进行过继细胞移植治疗时，需要非清髓化疗进行淋巴细胞清除，目的减少对于有限的细胞因子的竞争，以及清除抑制性淋巴细胞（如Treg），减少内源性T细胞对于抗原的结合，增加输注T细胞的活性。
Dudley等进行的临床试验显示，使用环磷酰胺和氟达拉滨进行非清髓化疗，清除内源性淋巴细胞，再进行TILs过继治疗，展示出超过50%的客观响应。 Dudley也试验了使用全身辐照（TBI）进行淋巴细胞清除，再输注TILs，结果显示2Gy的TBI组的客观相应是52%，而12Gy的TBI组为72%。 Dudley等也尝试了通过系统注射IL-2增加T细胞的功能和存活。（文献16.17）
但是淋巴细胞清除和IL-2注射都增加了毒副作用。因而可通过基因修饰，增加细胞存活和存续时间，减少淋巴细胞清除和IL-2的使用量。或者TILs自己携带编码细胞因子基因（如表达IL-2，IL-12，IL-2Rα），趋化因子受体CXCR2（其结合肿瘤表达的趋化因子CXCL1），趋化TILs到肿瘤微环境。
1.5 T细胞代谢谱
检测TILs功能除了IFN-γ，TNF-a，IL-2等细胞因子谱外，代谢谱也需要。可参考阅读：T细胞代谢与功能的关系
TILs作为携带肿瘤特异性抗原TCR的细胞，在免疫细胞治疗应该有很大潜力，Rosenberg等大佬们，也都做过很多工作，国内也有几家企业开始深入开发，期望好消息。
参考资料
