【2.4.6】tetra-VH IgGs

sam点评：

用库来筛选可以靶向不同的抗原的VH,然后组合到一起。没有看到关于计算啥事情呢？ VH替代VL，不需要考虑空间位阻么？

tetra-VH IgG format: 可通过在IgG（四VH IgG格式）的每个Fab臂中结合两个不同的可变重（VH）域来创建相似类型的抗体。VH用作构建基块，其中一个VH放置在其通常位置，而第二个VH代替常规IgG中的可变轻（VL）结构域。

一、介绍

具有完全完整的野生型IgG结构的一种特别有趣的双特异性形式是二合一抗体，也称为双重作用Fab（DAF，dual action Fab ），其中抗体的一个可变区结合了两种不同的抗原。这是Boström等人首先报道的。他通过诱变HER2特异性抗体Herceptin 构建了与HER2和VEGF结合的抗体。此后，此方法已用于生成与其他抗原组合（例如HER3-EGFR ，VEGF-血管生成素2 或IL4-IL5 ）结合的抗体。然而，构建以高亲和力结合两种抗原的DAF是具有挑战性的。在这些抗体中，结合表面重叠，因此当时只有一种抗原可以结合IgG的每个臂。这在DutaMab格式中已得到部分克服，在该格式中，抗体的结合位点仅限于6个互补决定区（CDR）中的3个，使CDR H1，H3和L2结合一种抗原，而CDR L1，L3和H2结合一种第二抗原。。因此，如果抗原大小和结合方向允许，这些DutaMab可以在每个Fab臂上同时结合两种不同的抗原。构建二合一抗体的另一种方法是将结合一种抗原的可变重链结构域（VH）与结合第二种抗原的可变轻链结构域（VL）结合起来。然而，所有这些策略都是困难，费时且昂贵的，并且目前缺乏用于简单构建双特异性二合一抗体类型的方法。

最小的抗体片段通常发现有抗原结合能力是VH结构域，和在骆驼科动物和鲨鱼点仅由重链组成的抗体已被发现。该发现已被用于发现和开发称为纳米抗体的单域抗体，最近由Mir等人综述。但是，我们假设不是使用一个小的纳米抗体，而是假设可以使用人类野生型VH来创建一个四价的完整IgG。

在这项研究中，我们产生了 tetra-VH IgGs，一种新型的双特异性，四价，二合一类型的抗体（图 1）。将VH域用作构建基块。分离结合的scFv后，通过噬菌体展示并鉴定结合的VH结构域，一个VH连接至重链的恒定重结构域1（CH1）（正常位置），而另一个VH连接至恒定轻结构域（CL）替代野生型IgG的VL。所选的VH结构域通常结合一种抗原或两种不同抗原上的不同表位。由于两个VH结构域彼此独立地结合，因此获得了四价抗体。这种“即插即用”形式具有正常野生型IgG的多个优点，并且包括产生四价IgG作为药物开发的替代形式的独特可能性。

二、方法与结果

1. 产生双特异性四价IgG分子的第一步是分离针对三种模型抗原CD40，OX40和4-1BB的单特异性抗体片段。从我们的噬菌体展示文库n-CoDeR 18（图 2a，S1a）中分离出靶标特异性细胞结合scFv（单链片段变量）。通过Sanger测序鉴定出的独特克隆得以再生，并使用转染的细胞（图2b，S1b）和重组蛋白（图 2c，S1c）确认了靶标结合 。总共分离出约100个克隆/靶标用于下游评估。

2. 为了鉴定与VH单独结合的克隆，与VL无关，制备了分离的单特异性scFv的亚文库。将所有与一个靶标结合的独特scFv的VH基因合并在一起，并与VL假人（VLD,VL dummy ）组合在用于生产Fab（片段抗原结合）的载体中，此处称为VH-VLD Fabs。

3. 双特异性四-VH IgG抗体的构建和结合分析

参考资料

• Scientific Reports volume 10, Article number: 1546 (2020).A bispecific IgG format containing four independent antigen binding sites. https://www.nature.com/articles/s41598-020-58150-z