【7.8.1.】FFPE样本

在组学研究中，如蛋白组学、代谢组学等，血液是常见的样本类型。然而，在这种常见样本类型的背后还存在一类更丰富的样本资源—FFPE（formalin fixation and paraffin embedding）样本，中文是指福尔马林固定石蜡包埋的组织样本。FFPE样本可当之无愧地称为病理科的“瑰宝”，因为它们承载着众多疾病相关信息；FFPE也是目前长期保存病理样本的金标准，在过去的几十年中，按照该方法，全世界已经存档了大量生物样品[1]。

然而，在过去，由于技术受限使FFPE样本无法最大程度发挥自身的价值，从而成为了尘封的“宝藏”。近年来，随着各种技术的发展以及研究的进步，FFPE样本的应用也逐渐多样化。从最开始应用于免疫组化进行疾病诊断和病理分型，到目前应用到各种组学研究中，FFPE样本即将迎来自身的“高光”时代。下面小编就带着大家一起梳理一下FFPE样本的相关知识。

1 FFPE样本出现的原因

为保护细胞结构的完整性，先使用福尔马林固定组织样本，然后使用石蜡包埋，以方便切成薄片的组织样本就是FFPE样本。之所以会出现FFPE样本，主要是因为可以在常温下较长时间地保存组织或制备检验所需的组织标本。

2 FFPE样本的制备步骤

其制备过程分为5个步骤，大致过程是将组织内的物质相互交联固定，并去掉组织中的水分，使用石蜡包埋以方便切片。具体步骤及每一个步骤的目的参见下图：

图1 FFPE样本制备步骤及目的

制备完成并进行切片后如下图所示，平时我们所说的送样时送10片左右即可，就是下面这种FFPE切片样本。

图2 FFPE样本切片

3、FFPE样本对DNA、RNA以及蛋白质等的影响

在FFPE样本的制备步骤中我们看到第一步是固定，这一步会使自由的分子链被交联在一起，从而起到固定组织的作用。但这一步也会对DNA等分子产生不利影响，比如使核酸容易出现片段化、蛋白与核酸交联等。最终导致我们很难获得高质量的DNA或者RNA分子，这也是制约FFPE样本在组学中应用的最大难题。

下图中的电泳图可以很好的展示出FFPE样本与新鲜组织样本提取的DNA和RNA的差别。可以看到新鲜组织提取的基因组DNA是一条清晰的条带，而FFPE样本提取的基因组DNA呈弥散状态。获得的RNA量方面，可以看到新鲜组织提取的RNA量远超过FFPE样本[2]。

图3 新鲜组织（左1-3）和FFPE样本（右1）提取基因组DNA电泳图比较

图4 FFPE样本（左）和新鲜组织样本（FF）提取的RNA总量差异

4、FFPE相关的技术发展

近年来，随着基础研究和分子生物学相关技术的不断发展，针对FFPE样本无法获得较高质量基因组DNA及RNA等方面的难题也逐渐得到解决。比如出现了专门针对FFPE样本提取基因组DNA、RNA的试剂盒，通过核酸分子的修复，把对核酸样本的破坏程度降到最低。又如，针对FFPE样本获得较低量核酸的情况，在二代测序文库的构建方面，出现了超低量样本的文库构建试剂盒等。所有这些技术的进步都促进了FFPE样本在各种组学研究中的应用。

5、FFPE样本在各种组学中的应用。

正因为不断发展的技术解决了FFPE样本应用中的各种难题，所以FFPE样本在各种组学研究中获得了广泛的应用。目前，查阅NCBI的pubmed数据库，我们可以从基因组、转录组、蛋白组、代谢组，甚至是微生物组中检索到FFPE样本的身影。也有研究对FFPE样本开展表观遗传学、空间转录组、蛋白修饰组学等研究。可以说，随着技术的不断发展，我们能想到的组学技术都在慢慢地应用到FFPE样本中。相信不久的将来，在科学研究中，FFPE样本会成为一种常规样本。

图5 FFPE样本在组学中的应用方向

六、其他

为方便大家对FFPE样本在各研究方向的应用有充分的了解，这里也在各方向下随机附上一篇研究文献供参考

1. 外显子组[3]：Peter Georgeson, et al. Evaluating the utility of tumour mutational signatures for identifying hereditary colorectal cancer and polyposis syndrome carriers. Gut. 2021Nov;70(11):2138-2149.doi: 10.1136/gutjnl-2019-320462. Epub 2021 Jan 7. 该文献通过外显子组测序技术来评估肿瘤突变特征在鉴定遗传性大肠癌和息肉病综合征患者的效用。

2. 转录组[4]：Madalee G Wulf, et al. Chemical capping improves template switching and enhances sequencing of small RNAs. Nucleic Acids Res. 2022 Jan 11;50(1):e2. doi: 10.1093/nar/gkab861. 该文献公布了一种新的方法“CapTS-seq”，用于FFPE样本的小RNA建库和测序。

3. 微生物组[5]：Alessandra Borgognone, et al. Performance of 16S Metagenomic Profiling in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded versus Fresh-Frozen Colorectal Cancer Tissues. Cancers (Basel). 2021 Oct 29;13(21):5421. doi: 10.3390/cancers13215421. 该文献主要介绍了在新鲜组织样本和FFPE样本中使用16S测序及RNA原位杂交技术来评估样品保存对肠癌相关微生物群表征的影响。

4. 蛋白组[6]：Corinna Friedrich, et al. Comprehensive micro-scaled proteome and phosphoproteome characterization of archived retrospective cancer repositories. Nat Commun. 2021 Jun 11;12(1):3576. doi: 10.1038/s41467-021-23855-w. 该文献中研究者评估了肺组织FFPE样本（磷酸化）蛋白质组学研究中蛋白质提取、定量、分析等方面的可行性。

5. 代谢组[7]：Alex Gomez-Gomez, et al. Targeted metabolomics in formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens: Liquid chromatography-tandem mass spectrometry determination of acidic metabolites in cancer research. Talanta. 2021 Feb 1;223(Pt 2):121740. doi: 10.1016/j.talanta.2020.121740. Epub 2020 Oct 7. 该文献旨在探索FFPE样本中靶向代谢组学的潜力。研究者开发了一种LC-MS/MS方法，用于定量FFPE样品中的酸性代谢物。

参考资料

• https://baijiahao.baidu.com/s?id=1748259675054891353&wfr=spider&for=pc
• [1]Stefano Amatori, et al. The Current State of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) from FFPE Tissues. Int J Mol Sci. 2022 Jan 20;23(3):1103. doi: 10.3390/ijms23031103.
• [2]Diana Abdueva, et al. Quantitative expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded samples by affymetrix microarrays. J Mol Diagn. 2010 Jul;12(4):409-17. doi: 10.2353/jmoldx.2010.090155. Epub 2010 Jun
• [3]Peter Georgeson, et al. Evaluating the utility of tumour mutational signatures for identifying hereditary colorectal cancer and polyposis syndrome carriers. Gut. 2021 Nov;70(11):2138-2149. doi: 10.1136/gutjnl-2019-320462. Epub 2021 Jan 7.
• [4] Madalee G Wulf, et al. Chemical capping improves template switching and enhances sequencing of small RNAs. Nucleic Acids Res. 2022 Jan11;50(1):e2.doi:10.1093/nar/gkab861.
• [5] Alessandra Borgognone, et al. Performance of 16S Metagenomic Profiling in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded versus Fresh-Frozen Colorectal Cancer Tissues. Cancers (Basel). 2021Oct29;13(21):5421.doi:10.3390/cancers13215421.
• [6] Corinna Friedrich, et al. Comprehensive micro-scaled proteome and phosphoproteome characterization of archived retrospective cancer repositories. Nat Commun. 2021 Jun 11;12(1):3576. doi: 10.1038/s41467-021-23855-w.
• [7]Alex Gomez-Gomez, et al. Targeted metabolomics in formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens: Liquid chromatography-tandem mass spectrometry determination of acidic metabolites in cancer research. Talanta. 2021 Feb 1;223(Pt 2):121740. doi: 10.1016/j.talanta.2020.121740. Epub 2020 Oct 7.