【7.1.3.1】杂交链式反应HCR
杂交链反应（Hybridization chain reaction，HCR）是Dirks等于2004年提出的一种新型探针方法技术[参考文献1]，它利用核酸链竞争杂交作为能量来源使信号放大，可以在室温下进行，不需要变温和其它酶的辅助。
一、HCR的原理
HCR的机理如下，设计发夹型探针H1和H2，H1包括a，b，c和b四个部分，其中b和b有18对碱基互补成双链作为H1的茎部，c为发夹结构的环部，a为在发夹结构茎部延伸出的单链粘性末端；H2包括c*，b，a和b四个部分。其设计和H1相似，a，b，c可分别与a*，b*，c互补。当没有引发链（ab*）存在时，虽然H1和H2中有部分链可以额互补，但由于H1和H2分别形成茎环，二者在溶液中均能稳定存在，不会相互杂交而彼此打开；当加入引发链ab时，ab首先与H1茎部的粘性末端ab互补，使H1的茎环结构打开，暴露出cb单链，打开H2的发夹结构，接着暴露出于与H1互补的ab，可以继续打开H1，依次循环往复。H1和H2在引发链引导杂交反应后，陆续打开发夹H1和H2，形成由H1和H2交替杂交形成的长链带缺口的双链DNA聚合物[参考文献2]。
图1 HCR的反应机理
二、HCR的扩增产物
HCR的扩增产物是长链带缺口的双链DNA，这种扩增产物的大小受到引发链浓度的影响而呈现不同的状态，图中的泳道2-7是六种不同浓度的引发链（0.0，10.0，3.20，1.0，0.32，0.1 uM）和1 uM的H1和H2的扩增产物电泳胶图。泳道1和泳道8是100bp和500bp的Marker。我们可以看到，当引发链较少时，主要形成的是2000bp以上的HCR产物，当引发链的浓度增加时，主要产物是50-500bp长的HCR产物[参考文献1]。
图2 HCR的扩增产物
三、HCR变体——二维HCR
在H1的5’末端增加一段凸出的不与目标序列（Target）结合的一段DNA，但这段DNA序列可以作为H3和H4这对发夹DNA链的引发链。在二维HCR中，目标序列的3’部分可以与捕获序列杂交，从而固定在固相载体上。而目标序列的5’端序列用于打开发夹型的H1，引发H1与H2参与的HCR反应，形成的长链带缺口的双链DNA聚合物。在这之后，洗去多余的H1和H2。加入H3和H4，引发第二轮的HCR反应。
四、单目标多次触发HCR(MHCR)
在茎环结构的捕获探针3’末端修饰巯基，通过金硫键固定到金电极上，在目的DNA存在时，茎环结构被打开，之后引物与位于发夹暴露出的茎部底端的一段序列杂交，加入DNA聚合酶和dNTP原料之后，引物开始进行延伸，将目的DNA取代。替换下的目的DNA又可以进另一个链替代反应。因此一条目的DNA可以产生无数个长的双链DNA，与传统的一维和二维HCR反应相比，可以获得更高的信号放大效果[参考文献3]。
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参考文献
- Dirks RM, Pierce NA, Triggered amplification by hybridization chain reaction, Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Oct 26;101(43):15275-8.
- Xu Y, Zheng Z, Direct RNA detection without nucleic acid purification and PCR: Combining sandwich hybridization with signal amplification based on branched hybridization chain reaction, Biosens Bioelectron. 2016 May 15;79:593-9.
- Zhu Z, Lei J, Liu L, Ju H,Label-free electrochemical DNA sensing with a one-target-multitriggered hybridization chain reaction strategy, Analyst. 2013 Oct 21;138(20):5995-6000.
