【6.4.2】HEK293细胞系

对于做分子生物学实验的人来说,HEK293细胞再熟悉不过了。常在文献中看到不同的HEK293名字,HEK293细胞极少表达细胞外配体所需的内生受体,且比较容易转染,是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。HEK293细胞的一个衍生株:293T/17的转染效率更高,成为广大研究者研究基因功能的一个强大工具。

众所周知,哺乳动物细胞作为蛋白的表达系统具有糖基化、乙酰化、硫酸化、硫酸化等翻译后修饰。而蛋白翻译后修饰,如糖基化修饰,会直接影响蛋白在体内的半衰期及稳定性和生物学活性、影响配体识别及结合,影响其免疫原性,影响胞间作用等等功能。

目前,哺乳动物细胞已被广泛用于重组蛋白、疫苗、抗癌试剂及其他临床相关的药物的生产中。

CHO细胞、BHK细胞、Sp2/0等细胞常被用于制备生物制药。然而这些小鼠来源的细胞与HEK293细胞相比,缺乏人的细胞翻译后修饰系统,因此与人源系统表达的蛋白有差异。目前,HEK293细胞被广泛用于生产蛋白、疫苗、抗癌试剂及重组腺病毒包被等。

一、特点:

1) 转染效率高;

2) 可悬浮培养用于大规模表达;

3) 表达蛋白结构最接近其在人体内构象;

4) HEK293细胞在培养体系中能够快速增长,高密度培养。

5) HEK293细胞与神经元细胞一样,对外界微环境较为敏感,利用这一特点,可用于药物发现及细胞毒性测试。

二、HEK293细胞起始

1973年,最原始的HEK293细胞来原于一个夭折的人类胚胎肾细胞中,将人的胚胎肾细胞中的转化入人5型腺病毒DNA片段,得到的细胞即为HEK293细胞。目前,HEK293细胞用于途非常广泛,常用于生产蛋白、疫苗、抗试齐及重组腺病毒包装等。

图1

三、不同293细胞的区别与使用范围

3.1 293T细胞

293T细胞由HEK293细胞衍生而来,是SV40 large T抗原稳转得到的细胞株,贴壁不牢。293T细胞还表达E1A蛋白,SV40 large T抗原,含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。293T细胞容易转染,用磷酸钙、PEI或脂质体转染,效率均可达90%以上。除用于基因表达及蛋白生产外,还用于慢病毒、逆转录病毒及腺病毒的包装。

293T Cells

1985年,表达SV40 T抗原的温敏等位基因的293T诞生,这使得含有SV40 ori的载体得以扩增,从而显著提高瞬时转染的表达水平。SV40 T可与p53形成复合物并抑制p53,从而可能进一步损害基因组完整性。需要注意的是,由于SV40大T抗原的存在,该细胞对G418耐药,因此在使用该细胞进行试验的时候应避免使用G418作为抗性基因筛选。

293细胞中转入SV40T-antigen基因形成的高转衍生株,即为293T细胞系。这使得包含SV40ori的质粒能够在该细胞系中显著扩增,从而促进表达载体的扩增,促进蛋白的表达。

293T细胞除了可用于各类基因表达及蛋白生产,还可用于高滴度逆转录病毒及其他病毒生产,如腺病毒及其他哺乳动物病毒。

293T/17 Cells

293T细胞中共转染入pBND 和 pZAP 质粒,获得的具有G418耐受的细胞系即为293T/17细胞系。该细胞系在保有293T细胞的优良性能之外,还具有高转染性的特点。

293T/17 SF Cells

293T/17 SF细胞系指的是在293T细胞中转入EBV基因形成的转化细胞系,该细胞系主要用于细胞的瞬时转染及蛋白表达。

3.2 293H细胞

293H细胞是293细胞驯化后得到的、能够在无血清培养体系下快速生长、具有高转染效率及高效蛋白表达性能的细胞系。该细胞系贴附牢固,主要用于噬菌斑检测等。

293H细胞则指的是将293细胞驯化后得到的能够在无血清培养体系下快速生长、具有高转染效率及高效蛋白表达性能的细胞系。另外,该细胞系贴附力好,而被用于噬菌斑检测等应用。

3.3 293A

293A (adherent)细胞是293细胞的衍生株,倾向于形成单层细胞(monolayer)。在进行病毒滴度测定的空斑试验(plaque assay)时,293A细胞是均匀的单层,没有细胞重叠和间隙。

3.4 293E Cells

293E细胞指的是在293-H细胞中插入EBNA-1基因的细胞系,该基因能够稳定表达EBV病毒的EBNA1蛋白。含有EBV复制起点(oriP)的重组表达质粒,能够在H293E细胞中复制,并实现蛋白的高效表达。

293-6E Cells

293-6E细胞则是在293-H细胞中插入截短过后的EBNA-1基因的细胞系,其能够在无血清培养基中高表达生产蛋白及病毒载体。

3.5 293F Cells

HEK293-F是293细胞系的一个快速增长的衍生细胞系,可以用于无菌悬浮培养。

293FT Cells

293FT细胞则是在293F细胞系中插入pCMVSPORT6TAg.Neo质粒的转化细胞系,能够快速增值,易转染,其能够用于慢病毒载体的生产。

293FTM Cells

293FTM细胞来源于Flp-In 293T-REx 293细胞,该细胞系中转入了ecotropic receptor质粒和MAPPIT(哺乳动物蛋白-蛋白相互作用阱)报告质粒,该细胞系主要用于蛋白相互作用关系的研究。

293Flp-InTMT-RExTM Cells

293Flp-In 293 T-REx细胞系是为了快速生成稳定的细胞系而设计的,它可以确保从Flp-In表达载体上获得的蛋白的均匀表达。这些细胞在转录活跃的基因组位点上包含一个稳定整合的FRT位点,有针对性的整合Flp-In表达载体,确保高水平目的基因。Flp-In t -293细胞系包含稳定整合的pFRT lacZeo和pcDNA 6 TR(来自T-REx系统)。用Flp- in表达载体和Flp重组酶载体pOG44共转染Flp- in细胞系,可将表达载体定向整合到每个细胞的同一位点,保证基因表达的同质性。

3.6 293S

293S(suspension)细胞是被驯化成能够悬浮培养且能够耐受低钙离子培养条件的293细胞系。

293SG是293S细胞用甲基磺酸乙酯诱变处理,蓖麻毒素选择后再转染pcDNA6/TR质粒得到耐受蓖麻毒素的细胞系。该细胞系为悬浮培养,缺少N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶 (N-acetyl-glucosaminyl transferase I, GnTI)活性,可促进蛋白的Man5GlcNAc2N-聚糖型糖基化修饰。该细胞系常用于同源的N-糖基化蛋白的表达。此外,该细胞系中具有四环素表达抑制基因,可用于四环素诱导的蛋白表达研究。

293SGGD细胞系是在293SG转染pcDNA3.1-zeo-STendoT质粒的细胞系,其主要用于糖基化工程研究中。

293S细胞则指的被驯化成能够悬浮培养且能够耐受低钙离子培养条件的293细胞系。1985年,使用逐渐适应性培养的方法(培养在低钙环境中),从HEK293细胞中构建出了HEK293S细胞。HEK293S后面的S是suspension(悬浮)的缩写,顾名思义,HEK293S就是悬浮的HEK293细胞。而这个细胞的构建过程大约花费了7个月的时间。

293SG Cells

2001-2002年293SG细胞出现,该细胞由293S经由甲磺酸乙酯(EMS)诱变得来,并筛选出蓖麻毒素抗性克隆。该品系缺乏N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶I活性(由MGAT1基因编码),因此主要用于Man5GlcNAc2 N-聚糖修饰糖蛋白。然后,获得含有TetR报告系统的糖工程细胞,可使用四环素诱导的蛋白表达。该细胞系被广泛用于生产均一的N-糖基化蛋白,并被称为293SG。同时还有用于蛋白质-蛋白质相互作用筛选的293FTM和糖工程技术293SGGD细胞系(2010年) 这类细胞系常用于同源的N-糖基化蛋白的表达。

293SGGD Cells

293SGGD细胞系则指的是在293SG转染pcDNA3.1-zeo-STendoT质粒的细胞系,其主要用于糖基化工程研究中。

3.7 什么是SV40?

SV40全名猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40)或猿猴病毒40(Simian virus 40),是一种多瘤病毒,也是一种DNA病毒,有造成肿瘤发生的潜在能力,不过通常会维持于潜伏感染(latent infection)状态。这种病毒是在1960年,于用来生产脊髓灰质炎疫苗的恒河猴细胞中发现。它由于在受感染的青猴细胞所产生的异常数量的液泡而得名。这种病毒在猕猴中是休眠而不引起症状。在野外很多猕猴种群均有发现,它极少造成疾病。然而,在具有免疫缺陷—由于,比如说,受猴免疫缺陷病毒感染—的猴中,SV40表现得非常像人的JC和BK多瘤病毒,造成肾脏疾病和有时是类似于进行性多灶性白质脑病的脱髓鞘疾病。在其它物种,尤其是仓鼠],SV40引起多种肿瘤,通常是肉瘤。在大鼠中,这种致瘤的SV40大T抗原被用来建立关于原始神经外胚层瘤和成神经管细胞瘤的脑肿瘤模型

SV40 T antigen

SV40大T抗原(猿猴空泡病毒40 TAg)是六聚体蛋白,它是衍生自SV40病毒的显性作用癌蛋白。TAg能够诱导多种细胞类型的恶性转化。TAg的转化活性很大程度上归因于它对视网膜母细胞瘤[pRb和p53肿瘤抑制蛋白的干扰。因此,SV40 T结合p53并导致细胞周期控制失调,从而使得细胞转化效率提高。

3.8 总结

小结:通过上面的描述,我们这里有一张更为详细的HEK293细胞谱系图

综合来看,HEK293细胞在转入SV40 T之后名字上会多一个“T”,该类细胞粘附生长并生长速度快,之后根据不同需求则有了不同的变体:

(1)悬浮培养用HEK293衍生细胞系,名字会加“S”或者“SF”,一般通过适应性试验得到 (2)高产逆转录病毒HEK293细胞系,转入带有SV 40启动子以及含有小鼠白血病腺病毒片段的载体,使得细胞高产腺病毒 (3)用于产蛋白的HEK293细胞 (4)用于包装慢病毒的HEK293细胞 (5)用于构建特异性表达蛋白的HEK293细胞。具体该怎么选择HEK293细胞,心里有数了吧

根据各自的用途归纳下来,293细胞主要的细胞系可分为293T细胞-瞬时转染,蛋白表达,293H/A细胞-噬菌斑或空斑实验、293E细胞-重组蛋白的生产、293F细胞-慢病毒的生产和293S细胞-糖基化蛋白的表达。

参考资料

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