【7.1】SELEX技术

核酸适配体的成功要归功于SELEX技术,即指数富集配体系统进化技术( Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment ),简介描述如下:

  1. 人工合成含有随机核苷酸的单链核酸(单链DNA或RNA),这些序列不同的核酸共同组成SELEX筛选文库。
  2. 将该文库与靶分子共同孵育,并通过各种分离途径将结合复合物与未结合序列分离,从而得到能与靶分子结合的适配体。
  3. 洗脱获得与靶分子结合的序列并对这些序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增生成次级文库,用于下轮筛选。
  4. 如此数轮反复后,挑选出富集的单克隆适配体并进行测序,即获得特异性识别靶分子的核酸适配体。

SELEX文库的构建

SELEX技术起始于人工化学合成的大容量(约10的15~17次方个)随机寡核苷酸文库。这些文库主要包括ssDNA文库和RNA文库, 其特点是寡核苷酸分子的中间部分是随机序列, 两端为固定序列。固定序列内含有及其他酶学反应相关引物的结合位点。随机序列一般含有35-40个核苷酸, 它赋予了每个核酸分子不同的空间结构, 决定了随机寡核苷酸库的容量及多样性。由于寡核苷酸随机序列的每个核苷酸都有ATGC四种可能性, 若随机序列由N个碱基组成, 则库容量为4的N次方。一般库容量越大的文库筛选到特异性结合靶分子的核酸适体的机率就会越高, 通常首轮筛选的库容量达到10的15次方, 即可满足实际筛选需要。

下面为随机寡核苷酸文库及上下游引物实例:

随机ssDNA文库:

CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-(N)35-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT

上游引物:CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT

下游引物:ATCCGCCTGATTAGCGATACT

理论库容在4的35-40次方,计算下来在10的21-24次方之间。但是实际上受到DNA合成量的限制。以上面的随机文库为例,计算出来1 OD只有1.33 nmol,根据阿伏伽德罗常数计算出来是8×10的14次方个分子。如果需要达到10的15次方库容,需要2 OD。如果需要达到10的17次方库容,需要125 OD。

关于随机文库的OD值与物质的量的换算关系,可以参考生工生物网站的oligo计算工具。

由于PCR只能产生DNA,不能产生RNA。所以要用SELEX进行RNA适配体筛选的话,需要对人工合成的单链核酸文库进行逆转录,将原始的DNA文库转换成RNA文库。一般的办法是在上游引物上添加一段T7 promoter序列,利用T7 RNA polymerase进行转录。

PCR之后单链DNA的获得过程

PCR产物都是双链,也可以通过不对称PCR,通过调整两条引物的比例,获得大量的DNA单链,随后通过电泳将扩增的单链DNA和引物分开。另外lambda exonuclease可以降解5’磷酸化修饰的DNA反义链,得到正义链单链,这种办法需要5’磷酸化的反向引物参与人工合成单链核酸文库进行PCR扩增放大过程。

参考资料

个人公众号,比较懒,很少更新,可以在上面提问题,如果回复不及时,可发邮件给我: tiehan@sina.cn

Sam avatar
About Sam
专注生物信息 专注转化医学