【7.2.1.1】Western blot
一、Western blot 技术起源
1975年，Edwin Southern发明了DNA杂交检测技术，命名为Southern blot。1977年，James Alwine、David Kemp和George Stark发明了RNA杂交检测技术，命名为Northern blot。两年后位于美国斯坦福大学的George Stark发明了将蛋白从电泳凝胶上转移到活化纤维素上的技术，随后Harry Towbin发展出更快速、简单的电转技术。1981年Neal Burnette正式将这一技术命名为“Western blot”。
二、Western blot 用来干什么？
（一）确定目的蛋白的表达情况
这是Western blot最常规的应用，如检测患者的标本与正常人的标本、实验条件处理后细胞与未处理的对照细胞之间目的蛋白的表达变化情况，通过灰度分析可以确定目的蛋白表达水平是升高还是降低。
（二）研究蛋白间的相互作用
这是与免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，CO-IP）技术相结合的一种检测蛋白质之间相互作用的常用方法。通过CO-IP技术将相互作用的蛋白质复合体分离出来后进行凝胶电泳，然后利用相互作用的蛋白质的特异性抗体进行检测。适用于对已知的蛋白质的相互作用进行检测，不适用于检测一个蛋白质未知的相互作用蛋白；也可以用于蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用的后续分析。
（三）确定目的蛋白的细胞定位
通过分别提取细胞不同部位的蛋白质，如膜蛋白、胞浆蛋白核蛋白或线粒体蛋白等，将分离出来的不同部位的蛋白质进行Western blot检测可以分别检测目的蛋白在不同部位的表达情况。
三、Western blot实验原理
Western blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过跑蛋白凝胶电泳，分离蛋白质样品，然后将凝胶转移到某种固相载体（如PVDF膜）。这个固相载体能以非共价键形式吸附蛋白质，同时能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以载体上的蛋白质或多肽作为抗原，在载体上孵育上对应的抗体进行免疫反应，然后再孵育已经标记好酶的二抗，经过底物显色来检测电泳分离的目的基因表达的特异蛋白成分。
https://www.yeasen.com/news/detail/73
我们平时说的跑蛋白胶一般就是指聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称为PAGE（polyacrylamide gel electrophoresis），聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应，有两种形式：非变性电泳（Native-PAGE）和变性电泳（SDS-PAGE）。非变性电泳（Native-PAGE），是在不加入SDS和巯基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用。非变性电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对生物大分子的鉴定有重要意义。在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
Polyacrylamide Gel Electrophoresis PowerPoint Presentation, free download - ID:345406 (slideserve.com)
变性电泳（SDS-PAGE），将蛋白质进行变性，令其打开折叠的空间结构，使抗体能结合到相应表位，是目前用于测定蛋白质分子量最好的方法。SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。强还原剂，如巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。有些蛋白至含有二聚体或多聚体，加入β-巯基乙醇可还原多聚蛋白之间和内部的二硫键，电泳的样品将会被完全还原成单体甚至亚基形式，不加还原剂的样品则会保持聚体的形式。由于SDS带有大量负电荷，当与蛋白质结合时，所带负电荷的量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因此掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。SDS与蛋白质结合后，还可以引起蛋白质构象的变化，使得不同蛋白质的SDS复合物在水溶液都近似于长椭圆棒，在电泳中的迁移率仅受分子量大小的影响，而不再受蛋白质原有电荷量和形状的影响，因此可测定蛋白质分子量。
https://www.antibodies.com/cn/western-blotting
Native-PAGE和SDS-PAGE操作上基本相同，只是Native-PAGE凝胶配制的组分中和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等，因此我们也主要来详细讲讲SDS-PAGE凝胶电泳的具体步骤。
四、Western blot的实验流程
Day1
4.1 配制蛋白分离胶
（一）所需材料和试剂
配胶用玻片、配胶用夹子、梳子、15mL离心管、不同量程移液枪、吸头；
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（APS）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
① 聚丙烯酰胺（30% Acr-Bis）甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构为蛋白质电泳提供载体。
配制：称取 150g Acr-Bis 粉剂(30%,w/v) ,充分溶解于400mL的去离子水,定容至终体积为500mlL,配制成溶液后应 4℃避光保存,3 个月有效。
② Tris缓冲液，pH 8.8/pH 6.8，pH变化会影响电泳的效果，所以制胶的过程要分清楚浓缩胶和分离胶的缓冲液。
配制：
1.5mol/LTris-HCl(pH8.0)：称量181.7g Tris，加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解，用浓HCl调节pH值至8.8，将溶液定容至1000ml，高温高压灭菌后，室温保存。
0.5mol/LTris-HCl(pH6.8)：称量60.57g Tris，加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解，用浓HCl调节pH值至6.8，将溶液定容至1000ml，高温高压灭菌后，室温保存。
（注：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。）
为什么有两种pH值的Tris缓冲液？Tris-甘氨酸SDS-PAGE是一种不连续电泳方法，因为需要配制两种浓度的胶：浓缩胶胶和分离胶。与分离胶相比，浓缩胶的丙烯酰胺浓度更低，pH值也更低（6.8 vs 8.8）以及离子组成不同。
蛋白在浓缩胶迁移时，蛋白质样品处于高迁移率离子Cl-和低迁移率离子甘氨酸之间，从而蛋白质发生“堆叠”，使蛋白在进入分离胶之前浓缩成一条紧密的带，相当于蛋白处于同一起跑线；
一旦蛋白质进入分离胶，甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，蛋白质就会根据区域电泳原理“去堆叠”并迁移，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。不同蛋白质的电泳迁移率取决于它们的分子量大小。
③ 10%SDS：十二烷基苯磺酸钠（SDS）消除蛋白质电荷，解离蛋白质间的氢键，取消蛋白质分子内的疏水作用，去多肽折叠（蛋白质变性）。
配制：称取10gSDS，加入90mL双蒸水中，加热至68℃以溶解SDS结晶，定容至 100mL体积，室温保存。
④ 10%AP：催化剂，最好现配现用。
配制：称取1g过硫酸胺干粉，加入10mL双蒸水，充分混匀后分装在1.5mL EP管中，保存于-80℃冰箱，AP在室温中会逐渐分解，使用时拿出一管4℃解冻。
（注：AP 4℃可保存使用2周左右，超过期限会失去催化作用。）
⑤TEMED：增加TEMED的量，胶的凝固速度会加快，但如果增加太多，胶凝固太快有可能导致凝固不均匀。
胶浓度的选择
聚丙烯凝胶的浓度越高，胶的分子孔径就越小，同样电泳条件下分子量大的蛋白质被阻挡在外难以进入胶，而分子量小的蛋白质则可以顺利通过筛孔并留在胶上。凝胶的浓度越低，胶的分子孔径就越大，同样电泳条件下分子量大的蛋白质则可以通过筛孔并得以在胶上进行分离，而分子量小的蛋白质则快速地从筛孔中跑走。因此通常根据目标蛋白分子量的大小选择凝胶的浓度，参见下表：
配胶步骤
（1）准备2个15mL离心管，分别做好“上层胶”“下层胶”标记，可简化为“上”、“下”标记
（2）将玻璃板、隔条洗净晾干后组成严密的灌胶板，安装后倒满水用于检漏，5min水的液面不下落即可将水倒出，证明安装装置可以用于下一步使用
截取自哔哩哔哩
https://www.bilibili.com/video/BV1WT4y1N7xK/?vd_source=6b6e7163abbf561506011f864a2276ff
（3）先配置分离胶即下层胶，按照如下配方，根据自身实验需要几块胶来选择配制体系（"！“表示有毒，需小心操作）
（4）混匀后将分离胶液缓慢注入两层玻璃板中，至距离玻璃板顶端约3cm处，给上层胶留出足够空间，加满水封胶，使分离胶面保持水平，同时避免产生气泡。
（敲黑板：动作别磨蹭，天气热的时候胶凝固得快，容易不均匀。除了加水封胶，也可以加乙醇或异丙醇，封胶的目的是把胶压平以及防止氧散到凝胶中抑制聚合作用）
（5）室温静置约30min，待胶凝固，把装置对着光线，当能清晰看到覆盖层和胶层中间存在一条线时，胶就凝好了。
（6）倒掉覆盖层的水，尽可能倒掉液体，用滤纸吸干水，避免滤纸直接接触到凝胶。
（7）按下表配制浓缩胶液（上层胶），缓慢加至分离胶上面，插入梳子，注意不要混入气泡，室温静置约30min
（注：加完TEMED后聚合反应就立即开始，不要耽搁，迅速混匀混合物进行下一步）
4.2 蛋白电泳
（一）所需材料和试剂
蛋白样品（用1×Loading buffer制备，即1×SDS凝胶上样缓冲液），电泳液，电泳仪，不同量程移液枪，吸头；
5×电泳液（Running Buffer）配制：分别称取 Tris 粉末 15.1 g、甘氨酸粉末 94g 及 SDS粉末 5 g，先用 800 ml 蒸馏水充分搅拌使之完全溶解，然后补加蒸馏水定容至 1 L，再次混匀充分，常温保存，临用时加入蒸馏水稀释为 1×工作液。
1、安装电泳装置：待胶凝固后将胶连同玻璃板从架子上取下装进电泳内槽，加样面向内，将内槽放进电泳外槽，内槽加满电泳液（注意内槽安装的密封性，防止漏液），外槽加入电泳液至内槽高度约1/3处（外槽有相应的刻度标识）。
（注：上层胶凝好后，小心拔下梳子，用去离子水洗涤加样槽，已除去未聚合的丙烯酰胺溶液。必要时可在用带针头的注射器来扶直上层胶的齿）
截取自哔哩哔哩
https://www.bilibili.com/video/BV1Sa411b7y5/?vd_source=6b6e7163abbf561506011f864a2276ff
2.上样、电泳：用10μL加样枪将蛋白溶液分别加进各个泳道，20～40μg/孔，其中一泳道加入5μL的蛋白marker（可用1×loading buffer补至和旁边泳道相同体积）。接上电源，先用50-85V的低电压使样品通过浓缩胶，30min后当蛋白Marker到达分离胶后再将电压调至100-130V，直到溴酚蓝到达胶的底部（约1.5h），关电源停止电泳。
4.3 转膜（这里我们采用常用的湿转法）
（一）所需材料和试剂
转膜夹子（包括海绵和滤纸），转膜用的盆，PVDF膜，转膜用切胶刀，冰盒冰块，洗膜盒子，电转液，TBST或PBST，5%脱脂奶粉或5%BSA，甲醇，电转装置
5×转膜液（TransBuffer）配制：分别称取 Tris 粉末 15.1 g、甘氨酸粉末 72.1 g，先用800ml蒸馏水充分搅拌使之完全溶解，然后补加蒸馏水定容至 1 L，再次混匀充分，4℃保存；使用时按照“5×转膜液:甲醇:蒸馏水=1:1:3”比例配成 1×工作液，配好后置于4℃或者冰上预冷。
1×TBST 缓冲液（1L）：先配置10×TBS：分别称取 Tris 粉末 12.1g、NaCl 粉末 88 g，先用800 ml蒸馏水充分搅拌使之完全溶解，然后用浓盐酸调 pH 值至 pH=7.5~7.6，补加蒸馏水定容至总体积1 L，用时稀释成1×，再加1mL Tween-20再次混匀充分后保存于 4℃待用。
5% 封闭牛奶或5%BSA：称取脱脂奶粉或BSA粉末 1g 溶于约 20ml 1×TBST 缓冲液中，放在摇床上至完全溶解，现用现配。
1、卸胶板：电泳完毕后，从电泳装置上卸下玻璃板，小心撬开玻璃板，将浓缩胶切去，在凝胶底部紧靠最左边的孔的位置切下一个角，以标注凝胶的方位
2、准备6张3mm滤纸和1张PVDF膜，转膜前PVDF膜必须用甲醇浸泡5-10分钟。在托盘中加入少量转膜缓冲液，将滤纸浸泡于其中。
（敲黑板：转膜时总报错的同学看这里，PVDF膜和滤纸的大小都应与凝胶大小基本吻合，如果滤纸或PVDF膜的面积远大于凝胶，滤纸和膜多出的边缘就大有机会接触，造成电流短路而使蛋白不能从凝胶向PVDF膜转移。）
3、在倒有转膜缓冲液的托盘中按顺序制作“三明治”：（黑-）海绵1张→滤纸3张→凝胶→PVDF膜→滤纸3张→海绵1张（白+），记住口诀：黑胶白膜。以防放错，导致膜转反了。各层之间不要有气泡，必要时可用滚棒在每层滚一滚，以排除气泡。
4、将“三明治”夹紧后放进电转内槽（“三明治”夹子的黑面对着内槽的黑面，夹子的白面对着内槽的红面），再将内槽放入电转外槽中，外槽再放入冰盒，加满预冷的电转液，将整个电转外槽置于盆中盆内装满冰，以防电转时产热使蛋白降解。
转膜时间和转膜电流根据蛋白分子量大小而不同，一般可用在350mA, 90min条件下转膜，蛋白越小，需要的时间越少，否则就会转过了转到滤纸上。
4.4 一抗孵育
1、封闭：转膜结束后将膜取出（与胶接触的一面朝上摆放），用5%脱脂奶粉封闭，室温封闭1-2h
（注：做蛋白磷酸化相关的封闭液用TBST配制，以及后续洗涤都用TBST，避免磷酸根离子对实验造成干扰，其他则可以用PBST。如果非特异性背景依然很高，可将脱脂奶粉浓度适当提高至10%）
2、孵育一抗：膜封闭结束后用1×TBST溶液洗3次，5min/次。按照抗体说明的推荐浓度稀释抗体，将膜放入稀释好的抗体溶液中，4℃摇床或旋转孵育过夜，每个实验室孵育抗体的方式都不太一样，大家根据自己情况选择即可。
（注：除了商业化抗体，当一抗为自身制备的抗体时，可按照如下比例稀释：
多克隆抗体：1：1000~1：5000
杂交瘤细胞培养上清液：1：100
带杂交瘤小鼠的腹水：1：1000~1：10000
如果抗体敏感性很差，可室温下孵育长达18小时或4℃孵育36小时。）
Day2
4.5 孵育二抗
1、洗膜：一抗孵育结束后将膜取出，用1×TBST溶液洗3次，10min/次
2、孵育二抗：再将膜放入封闭液稀释好的二抗溶液中，室温（RT）孵育1-2小时
（注：一抗为抗蛋白的特异性抗体，二抗为anti一抗种属的抗体。比如一抗为anti-actin的兔源IgG抗体，二抗就为HRP goat-anti rabbit IgG其他种属的抗兔抗体，并且偶联辣根过氧化物酶HRP用于后续发光，有些商业化一抗本身就带HRP，所以就不需要孵育二抗，直接可以发光显影）
3、洗膜：二抗孵育结束后将膜取出，用1×TBST溶液洗3次，10min/次
4.6 发光显影
配制ECL发光液（A:B=1:1），将膜取出，把发光液加在PVDF膜上孵育5分钟左右后，上机显影、拍照。
（注：一般使用的发光液A和B分别是鲁米诺和过氧化氢，在辣根过氧化物酶（HRP）的催化作用下，鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。在发光过程中不需要消耗HRP，HRP只是起催化作用，所以只要HRP没降解失活，每次发光后，洗一洗膜是可以重复加发光液的。但HRP作为一种蛋白酶，在室温放置时间过长，是会降解的；同时在发光过程中有什么物质污染了膜的话,也有可能灭活膜上的HRP。）
4.7 结果分析
Western blot结果的半定量分析可以利用灰度分析和光密度分析法。
目的蛋白灰度（或光密度）值=目的蛋白灰度（或光密度）/内参蛋白灰度（或光密度）
（注：灰度值或光密度值只是一个相对值，不同组间的灰度值对比，反映的是不同组间目的蛋白的变化趋势，并不是绝对定量值。常用的分析软件为Image J和Photoshop）
A.Trx蛋白表达水平；B.Image J分析数据；C.结果成图
使用Image J软件对Western blot结果进行分析：
如上图，需分别分析出1～4泳道Trx蛋白的条带灰度值和5～8泳道β-actin蛋白的条带灰度值，然后计算图B中1～4泳道的intDen值分别比上5～8泳道的intDen值，即得每个样本的Trx/β-actin灰度值，最后将各个样本计算出来的Trx/β-actin灰度值进行归一化处理然后作出柱状图，即得图C的Western blot半定量柱状图。
参考资料
- https://mp.weixin.qq.com/s/F0qySwzOM2IH0APTnWAHhg
- [1] Hirano S. Western blot analysis. Methods Mol Biol. 2012;926:87-97.
- [2] 林秋雄, 吴炳义. 生物医学基础研究使用手册[M]. 人民卫生出版社, 2021
- [3] 陶永光. 肿瘤分子生物学与细胞生物学实验手册[M]. 湖南科学技术出版社, 2014.
