【8.3.1】新抗原mRNA疫苗

新抗原是癌症特异性抗原，由癌细胞基因组中的体细胞突变发展而来，具有高度免疫原性且不受中枢耐受性影响。由于大多数新抗原对于每个患者的癌症都是独一无二的，因此需要灵活且有效的疫苗技术来开发个性化的新抗原疫苗。体外转录的 mRNA 就是这样一个技术平台，并且已经被评估用于在体外和体内将新抗原递送到专业的抗原呈递细胞。

一、简介

IVT mRNA 与其他疫苗相比具有不同的优势，例如基于蛋白质/肽、病毒载体或 DNA 的疫苗。

1. 首先，IVT mRNA 具有很高的安全性。它是一种非传染性载体，不会整合到宿主基因组中；因此，没有感染或插入突变的风险。此外，IVT mRNA 仅短暂存在于转染细胞中，因为它会被细胞内核糖核酸酶 (RNase) 迅速降解。
2. 然而，如果需要的话通过分子化学修饰和序列工程其寿命可被调制。IVT mRNA 可以通过与模式识别受体 (PRR) 的相互作用引发潜在有害的 I 型干扰素 (IFN) 反应。然而，这是可以避免的，因为通过使用化学修饰的核苷酸和在生产协议中加入纯化步骤，IVT mRNA 可以使 PRR 不可见 。
3. 从mRNA模板蛋白表达效率已大大由于修改到mRNA分子和序列优化改进，使其更稳定，耐用且易于被翻译成所编码的蛋白质。
4. 此外，通过调整递送方法，可确保 IVT mRNA 在应翻译的细胞质中递送。
5. 此外，将仅针对 mRNA 编码的蛋白质而不是针对 mRNA 载体产生免疫反应，因为该 mRNA 是最小的遗传载体。

因此，可以在不因抗载体免疫而失去效力的情况下执行初免-加强疫苗接种方案。IVT mRNA 的制造过程快速、廉价且可扩展，从生物技术制造的角度来看，这很有吸引力。原则上，专门用于 mRNA 生产的设施可以快速生产针对任何给定目标的疫苗，同时对工艺和配方进行最小的调整。后者是用于新抗原疫苗开发的 mRNA 的主要优势。

图1 Key components of in vitro transcribed mRNA that determine the level and duration of expression of the encoded protein. The components that can be modulated are shown in blue, while the effect of modulating these components is shown in green. Abbreviations: 3′ poly-A, three prime polyadenylic acid tail; 5′ cap, five prime cap; PRR, pattern recognition receptor; UTR, untranslated region.

三、新抗原的鉴定和验证

Figure 2 Schematic representation of the workflow for neo-antigen identification. Abbreviations: IP, immunoprecipitation; MAE, mild acid elution; MS, mass spectrometry; NGS, next-generation sequencing; WGS, whole exome sequencing; WES: whole exome sequencing.

为了有效识别新抗原，NGS 与计算机 T 细胞表位预测算法相结合，评估潜在新抗原的 HLA 结合亲和力。例如 IEDBtools、MHCflurry 和 MHCnuggets

质谱 (MS) 是一种有趣的策略，用于检查和验证 HLA 分子中新表位的呈现。MS 是一种用于检测电离肽、完整蛋白质和小分子的先进分析方法。已经努力进一步改进 MS，例如，将其添加到高压液相色谱以确保更高的样品纯度，或通过实施串联质谱，从而获得更高的特异性 [ 82 ]。单独使用 MS 不足以作为新抗原鉴定方法，因为它需要潜在目标的先验知识，尽管蛋白酶体中剪接的肽、具有翻译后修饰 (PTM) 的肽和来自非-编码区 [ 83]。然而，由于其对 HLA 肽组的高灵敏度、准确性和可重复的定性和定量，它为新抗原验证提供了一种有效的方法。

四、基于 mRNA 的癌症疫苗的历史

Figure 3 Timeline showing discoveries and advances in the development of mRNA-based cancer vaccines. Abbreviations: 3′ poly-A, three prime polyadenylic acid tail; 5′ cap, five prime cap; mRNA, messenger RNA; LNP, lipid nanoparticles; DCs, dendritic cells.

表1

五. mRNA 作为新抗原疫苗接种的平台

体外转录的 mRNA 代表了一种在体外和体内原则上向 APC 递送新抗原的创新方式。这种方法在开发速度、生产、可扩展性、可靠性、制造成本和功效方面提供了许多优势，从而将 mRNA 定位为制备癌症疫苗的主要候选者

表明内源性 mRNA 的免疫激活能力低于 IVT mRNA，这归因于核苷酸的自然翻译后修饰。这一观察导致广泛使用甲基化核苷和/或假尿苷来生产 mRNA，其显示免疫激活能力降低，稳定性和翻译能力增强。

• 需要佐剂。 下一代 mRNA 疫苗是用化学修饰的核苷酸产生的；因此，它们缺乏内在的免疫激活能力，这意味着需要佐剂。在基于 mRNA 的癌症疫苗中显示出优点的佐剂的例子是单磷酰脂质 A [ 135 ]、α-半乳糖苷神经酰胺 [ 3 ]、RNActive [ 149 ] 和编码 DC 增强蛋白的 mRNA，例如但不限于 TriMix mRNA [ 125，150]。这些佐剂以不同的方式起作用；然而，它们确保 mRNA 修饰的 DC 采用成熟的表型和功能。
  • 其次，CTL 的激活需要 CD4 + T H 1 细胞的支持，以确保这些 CTL 的全部功能[ 54 ]。将抗原呈递给 CD4 + T 细胞发生在 MHC-II 分子中，这些分子装载在 MIIC 区室中，其中含有来自外源性抗原的肽。当使用 mRNA 作为递送抗原的方法时，必须通过将抗原序列与 MHC-II 靶向信号，如不变链的信号序列、溶酶体相关膜蛋白（LAMP或 DC-LAMP）偶联，将抗原引导至这些隔室。 [ 2 ,54 , 55 ]。激活的 CD4 + T H 1 细胞以多种方式影响 DC，确保 CTL 激活，其中包括通过 CD40-CD40L 介导的 DC 许可 [ 151 ] 和 IFN-γ 的产生 [ 152 ]，两者都刺激 IL-12 的产生。值得注意的是，CD4 + T 细胞可以发挥细胞毒性，因此可以在没有 CTL 的情况下引导癌细胞排斥 [ 4 , 5 ]。

关于新抗原疫苗，绝大多数免疫原性新表位被荷瘤 C57BL/6 小鼠的 CD4 + T 细胞识别[ 50 ]。这表明 CD4 +的关键作用新抗原导向的抗肿瘤免疫反应中的 T 细胞。最近发表的新抗原疫苗试验的结果进一步支持了这一点，这些试验表明存在新抗原特异性 CD4 + T 细胞，即使是使用预测与 MHC-I 结合的新表位进行疫苗接种

mRNA 疫苗的生产始于计算机抗原的设计，提供快速生产和临床前评估的优势，鉴于新抗原，这可能需要通过肽组学和/或评估新表位来评估新表位的正确呈现-表位的免疫原性。这可以加速选择适合个性化癌症疫苗接种的新抗原。尽管每种新抗原的序列不同，但生产过程是标准的，由于共同的制造过程和基础设施，减少了疫苗生产的时间和成本。生产过程从 DNA 模板的克隆和线性化开始，以使用 RNA 聚合酶（T3、T7、SP6）生产编码 mRNA 的多个拷贝。

• 化学修饰的核苷酸通常用作构建模块以降低 PRR( pattern recognition receptor ) 的感知并提高翻译效率 [ 32 , 153 ]。
• 添加 5' 帽和 3' 多聚 A 尾可以在（酶促）体外转录反应期间或之后完成 [ 154 , 155 , 156 , 157 ]。
• 使用酶 DNase 去除 DNA 模板，使用 LiCl/NaCl-EtOH 沉淀或使用 dT 微珠纯化 IVT mRNA [ 158 ]。纤维素 [ 159 ] 或 HPLC [ 32 ] 纯化，或 RNase III 酶处理 [ 160]]，可用于去除污染物，例如双链 RNA (dsRNA)，这些污染物是由 RNA 聚合酶过度活跃引起的 [ 161 , 162 ]。 这也降低了 PRR 感知并提高了转化效率。
• 值得注意的是，IVT mRNA 可以根据良好生产规范 (GMP) 生产，因为质粒 DNA、酶和其他试剂可作为 GMP 级起始材料从商业供应商处获得。IVT mRNA 生产过程可以标准化，允许快速生产任何感兴趣的蛋白质，使这种方法非常适合纳入新抗原疫苗管道。

六、新抗原 mRNA 的研究

对 www.clinicaltrials.gov 的查询显示，目前正在进行 12 项关于将新抗原 mRNA 直接递送至 APC 的临床试验，包括 TNBC 的研究。表 2）。在这些研究中，IVT mRNA 使用各种递送途径进行给药，要么在 LNP 中配制，要么仅溶解在适当的缓冲液中（裸 mRNA）。 这就引出了一个问题：“这些不同的给药途径和配方策略将如何影响疫苗效力？”

7. 未来展望

7.1. 新抗原预测和优先排序

NGS 和生物信息学在新抗原鉴定工作流程中的实施导致了新抗原来源的发现，包括癌症特异性过表达、选择性外显子剪接、内含子保留、基因融合以及 SNV 和 INDEL [ 168]]。MS 和 T 细胞反应性研究证实了这些发现。然而，值得一提的是，与生物信息学预测的文库相比，MS 验证的新抗原的比例相当有限。这可能是由于计算机预测的系统偏差以及抗原加工中的生物学未知因素所致。由于使用的训练算法，新抗原预测工具通常会有偏差。例如，NetMHCpan 使用来自免疫表位数据库的病毒表位进行训练，导致对病毒样新抗原的选择偏向。有证据表明与微生物表位具有同源性的新表位具有免疫原性 [ 15 , 61 ]]。尽管如此，这种选择偏倚避免了忽略其他潜在有趣的新抗原的风险。此外，对于频繁的 HLA 类型（例如，HLA-A2），有多个训练集可用，而针对不常见的 HLA 类型的训练集在很大程度上缺失 [ 74 , 168]]。将蛋白质到肽处理和 HLA 肽结合的生物学方面实施到训练算法中是另一种改进有效新表位的计算机预测的策略。有一些工具可以考虑免疫蛋白酶体对蛋白质的肽切割和加工，包括用于 HLA-I 呈递的 NetChop20S、NetChopCterm 和 ProteaSMM，以及用于 HLA-II 呈递的 PepCleaveCD4 和 MHC NP II。考虑肽装载方面的不同方法，例如抗原衍生肽对抗原加工转运蛋白的亲和力，也在开发中 [ 169]]。一般而言，对现有预测算法的持续改进和修订很可能会产生最佳预测工具。这可以通过对通过生物信息学、MS 和新表位免疫原性测试获得的数据进行连续比较来实现。新抗原疫苗接种试验产生的数据增加肯定会促进改进和完善用于新抗原识别的预测算法 [ 170 ]。此外，在多种癌症类型的癌症患者中发现了由致癌驱动突变引起的共享新抗原[ 171]。]。这些共享的新抗原可能有助于制造更广泛适用的新抗原癌症疫苗。这里的一个例子是编码四种最常见 KRAS 突变的 mRNA 疫苗，称为 mRNA-5671。该疫苗正在针对 KRAS 突变的结肠癌、胰腺癌或肺癌患者进行 I 期临床试验，作为单一疗法或与派姆单抗、PD-1/PD-L1 阻断疗法联合使用 ( NCT03948763 )。随着时间的推移，将在患者和肿瘤类型中识别出更多这些共享的新抗原，从而促进新抗原 mRNA 疫苗的快速发展 [ 172 , 173 ]。

7.2. 新抗原免疫原性筛选

已经开发了评估 T 细胞反应性的测定法，以确定候选新抗原的免疫原性。T 细胞活化标志物（例如 4-1BB）的上调或 IFN-γ 的产生已被确定为 T 细胞对所呈递的新表位特异性的量度 [ 91 ]。此外，已经使用四聚体对 TCR 进行染色，然后选择这些 T 细胞并进行 TCR 测序 [ 92 ]。然而，这些方法不是高度敏感的，并且根据刺激方案，可能会出现高背景并使解释变得困难。因此，丹尼洛娃等人。[ 174] 介绍了一种更灵敏的方法来筛选新表位反应性 T 细胞。在这种方法中，短期肽刺激 T 细胞培养物的 TCR 测序与生物信息学平台相结合，以识别抗原特异性克隆型扩增。嵌合受体、SABR 和 MCR 包含一个候选新表位，该候选新表位连接到与 CD3ζ 结构域融合的抗原呈递分子并在 NFAT-GFP 报告细胞中表达，也已被用作 T 细胞筛选的替代方法[ 93 , 94]。通过同源 TCR 结合抗原呈递分子中的新表位导致 Jurkat 报告细胞中的 GFP 表达，从而允许它们选择用于随后的新表位测序。这种基于报告基因的测定可以实现对 T 细胞靶向新表位的无偏见和高通量识别。这可以使用 mRNA 作为这些报告细胞中嵌合抗原表达的平台来实现，因为编码这些嵌合受体的 mRNA 的制备速度比病毒载体（目前用于报告细胞修饰的方法）更快，并且因为 mRNA 可用于实现蛋白质表达在这些报告细胞中 [ 175 , 176 ]。

7.3. 监测新抗原疫苗的功效？

新抗原 mRNA 疫苗的临床试验大多处于早期阶段（表 2）。对于这些，疫苗的安全性和耐受性（通常增加剂量）是主要目标。然而，免疫活性的评估（所谓的免疫监测）和肿瘤反应（例如生物标志物检测）可以在早期解决并在关键试验中继续进行。这将提供关于个体患者新抗原疫苗成功或失败的额外信息。这很重要，原因有几个。对疫苗新抗原的反应程度因患者而异。这使比较患者之间的临床结果变得复杂。然而，在新抗原发现过程中，使用 HLA 亲和力、疏水性等参数根据预测的免疫原性对新抗原进行评分。测量免疫激活可以将反应的大小与新抗原的免疫原性评分相关联，并可能揭示成功的新抗原应遵守的最小免疫原性评分。此外，描述了肿瘤细胞抵抗 T 细胞介导的攻击的多种机制。即使引发了新抗原特异性 T 细胞，这些也可能妨碍临床获益。目前，有数据支持将新抗原疫苗接种与其他（免疫）疗法相结合的想法。

7.4. 与其他免疫疗法联合使用

在 T 细胞介导的攻击压力下，肿瘤会产生耐药机制。Sahin 等人的开创性研究。[ 19 ] 证实，在新抗原特异性 T 细胞的攻击下，肿瘤会产生耐药机制，例如一名患者体内 β2-微球蛋白缺乏的黑色素瘤细胞的生长，以及需要额外的 PD-1 阻断以实现完全另一名患者的反应。

人们普遍认为，结合不同的免疫疗法可能会使免疫系统比肿瘤更聪明。在这方面，诱导针对多个新表位的 T 细胞的新抗原 mRNA 疫苗可能受益于支持疫苗诱导的 T 细胞或激活具有互补活性的其他免疫效应子的策略。渗入 TME 的 T 细胞可能会遇到过多的免疫抑制细胞和分子。因此，逆转免疫抑制的策略是与新抗原 mRNA 疫苗组合的主要候选者。如上所述，通过将新抗原 mRNA 疫苗接种与 PD-1 抑制相结合，已经在晚期转移性黑色素瘤患者中实现了完全缓解 [ 19]]。可以通过多种方式激活具有互补活性的免疫效应物。例如，在 CD1d 阳性肿瘤的情况下，可以在 mRNA 疫苗配方中加入 α-半乳糖苷神经酰胺以刺激 NKT 细胞 [ 3 ]。另一种可以设想的策略是靶向肿瘤细胞表面的抗原以激活补体、巨噬细胞或 NK 细胞，通过这种方式从多个角度攻击肿瘤细胞，使逃避免疫变得更加困难 [ 177]]。此外，化疗和/或放疗的使用可能会引起人们的兴趣，因为这些策略有能力改变肿瘤免疫微环境的组成。在 NCT4161755 研究中，新抗原 mRNA 疫苗和 atezolizumab 与化疗药物 mFOLFIRINOX 联合使用。这种药物已被证明可以增加 CTL，同时降低调节性 T 细胞；因此，它们可以支持由新抗原 mRNA 疫苗激活的新抗原特异性 CTL [ 178 ]。其他地方提供了对与新抗原疫苗联合探索的策略的扩展综述，包括基于 mRNA 的新抗原疫苗[ 179 ]。

八、结论

与基于 TAA 的癌症疫苗相比，基于新抗原的癌症疫苗有望提高肿瘤特异性和免疫原性。IVT mRNA 平台可用于候选新表位的免疫原性测试，例如通过将其纳入使用嵌合受体的报告基因检测，以及用于新抗原疫苗接种本身，除了能够提供新表位的蛋白质外，还可以提供新表位支持免疫激活。目前，基于 mRNA 的新抗原疫苗的临床经验很少。然而，第一批临床试验的数据令人鼓舞，值得进一步探索 mRNA 作为新抗原疫苗平台。不同正在进行的临床研究的结果将增加我们对有效新抗原 mRNA 疫苗的先决条件的理解，可能阐明优选的给药途径以及优选的mRNA制剂方法，冻干或溶解在适当的缓冲液中，封装在纳米颗粒中或已经离体转移到DC。总体而言，正在进行的临床试验的结果将促进治疗性新抗原 mRNA 疫苗的发展。

参考资料

• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7766040/ 。 Neo-Antigen mRNA Vaccines。 Journal ListVaccines (Basel)v.8(4); 2020 DecPMC7766040