【5.2.1.0】VAF，MAF，肿瘤纯度，MCF，CCF
一、VAF的概念和计算方法
VAF的全称是Variant Allele Frequency（变异等位基因频率）或Variant Allele Fraction（变异等位基因分数）。简单来说就是在基因组某个位点支持alternate/mutant allele的reads覆盖深度占这个位点总reads覆盖深度的比例。以VCF文件中的字段为例，其中DP代表Total Depth，AD代表Allele Depth，因此VAF的计算就是：
$V A F = = \frac{Allele Depth}{Total Depth} = \frac{AD}{DP} $
VAF用得比较多的地方是在二倍体germline的genotyping中，杂合位点的VAF在高深度（比如depth>80）情况下应该接近50%；如果VAF接近0.25/0.75说明基因组上可能还有另一份拷贝。
另一个应用场景就是癌症基因组的somatic genotyping。肿瘤组织、cfDNA、ctDNA、CTC genotyping的结果中会包含正常的allele（与正常体细胞一致）以及突变的allele，其中突变allele的所占的比例就是VAF。VAF可以用于推断肿瘤的异质性和肿瘤纯度，此外VAF的高低可能会影响癌症的预后。
在VCF文件中，通常以AD这个字段表示allel的测序深度，多个allel的测序深度用逗号连接，DP表示该位点总的测序深度， 举例如下。
AD = 4,8
DP = 12
AD这个字段有4和8两个allel, 在二倍体生物中，第一个数字代表ref allel的测序深度，第二个数字代表alt allel的测序深度，所以该位点在该样本中的VAF=8/12。
对于突变位点而言，还有一个频率，称之为MAF, 全称是Minor Allel Frequency, 描述的是次等位基因在人群中的频率，从这里也可以看出VAF和MAF的不同支持，这两个概念都是针对allel 频率而言的，MAF描述的是allel在人群中的频率，而VAF描述的是allel在某个样本中的频率。
VAF的值的大小有什么含义呢？以二倍体生物为例，假设所有的细胞中该位点都是杂合的，那么50%的染色体上包含了ref allel, 另外50%的染色体上包含了alt allel, 则测序结果中该位点的VAF值应该为0.5。对于germline genotype而言，一个可靠的突变位点其VAF的值应该在0.5附近。
如果VAF偏离0.5很多，说明对应的染色体区域在细胞中不在是两拷贝了，比如VAF的值为0.25， 说明包含alt allel的染色体占1/4, ref allel的染色体占3/4, 按照所有细胞突变情况完全一致的假设，只有当每个细胞中出现了三份拷贝，两份拷贝是ref allel, 一份拷贝是alt allel时，会出现0.25的情况。
对于生殖变异的检测，认为其VAF的偏移来源于拷贝数的变化，对于体细胞检测而言，更多的认为VAF的偏移来源于肿瘤细胞的异质性。在肿瘤组织取样时，不可避免的会混入正常的体细胞，而且考虑到肿瘤微环境本身的复杂性，在肿瘤组织中也会浸润诸如免疫细胞等其他细胞类型，肿瘤细胞本身也可以划分为不同的亚型，考虑到以上种种因素，肿瘤样本是一个多种细胞类型的混合物，更多的认为其VAF的偏移来源于不同细胞类型占比的变化。
在进一步简化这个模型，将肿瘤样本划分为正常体细胞和肿瘤细胞两种，ref allel等于正常细胞x2 + 肿瘤细胞， alt allel 等于肿瘤细胞，VAF的值就可以反映肿瘤细胞和正常细胞的比例，可以用来推测肿瘤纯度。在肿瘤基因组研究中，还会将VAF当做一个marker, 取样本中所有位点VAF的均值当做一个指标，可以比较不同分组，不同肿瘤中VAF分布的差异，也可以根据VAF的高低将样本分组进行生存分析。
二、MAF的概念和计算方法
MAF的全称是Minor Allele Frequency（次等位基因频率），是群体遗传学中的概念。MAF描述的是群体中丰度次高（第二高）的allele的频率。打个比方，在1000个人的群体中，某个位点有3种碱基类型：A、C、G。其中A碱基的频率是0.6，C碱基频率0.3，G碱基频率0.1，那么次等位基因频率指的就是C碱基的频率0.3。MAF可以用来区分某个allele是常见的多态性还是稀有变异。
要注意的是MAF在生物信息学中可能还指代Mutation Annotation Format、Multiple Alignment Format，也看到有人用mutant allele frequency表述VAF的概念，所以一定要注意区分。
三、肿瘤纯度的概念和计算方法
肿瘤纯度（tumor purity）指的是样本中肿瘤细胞占所有细胞的比例。因为取样过程很难保证取到的所有细胞都是肿瘤细胞，并且混杂的正常体细胞会对后续的分析产生影响（比如基因的表达水平），因此在生物信息学分析中最好计算肿瘤纯度并做相应的校正。
常用的估算肿瘤纯度的生物信息学工具有：ABSOLUTE、PyClone、SciClone、EXPANDS、ESTIMATE等。
四、MCF的概念和计算方法
MCF（Mutant Cell Fraction）指的是包含某个SNV的细胞比例。在简化模型下——不考虑CNV，并且是二倍体杂合SNV的时候，MCF就是VAF的2倍：
MCF = VAF * 2
五、CCF的概念和计算方法
癌细胞分数(CCF)：如果肿瘤起源于一个单个细胞(癌症进化的克隆理论认为，癌症源自单个祖细胞)，该肿瘤被认为是一个克隆，起始突变存在于每一个肿瘤细胞中，被称为CCF为1，即癌细胞是克隆性的，由普遍扩散所致。CCF<1的细胞组成的肿瘤称为亚克隆，即正在进行的扩增的一部分。但是，事实情况下即便一个特定的突变出现在一次活检中，CCF为1，在接下来的肿瘤采样中可能部分或者完全检测不到这个突变，因为观察到的变异等位基因频率取决于正常细胞混合物(纯度)的数量和局部拷贝数。
肿瘤异质性：肿瘤的异质性是恶性肿瘤的特征之一，是指肿瘤在生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变，从而使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。
CCF（Cancer Cell Fraction）指的是肿瘤细胞中包含某个SNV的细胞所占比例。CCF和MCF之间也可以换算，设肿瘤纯度为α，在不考虑CNV，并且是二倍体杂合SNV时：
$ CCF = \frac{MCF}{\alpha} $
参考资料
