【9.1.1】荧光原位杂交技术(FISH)
一、FISH的前世今生
在FISH技术问世之前，基于20世纪60年代，放射性核素探针的原位杂交方法，检测间期染色体和分裂期染色体上特定DNA和RNA序列的方法，该方法存在操做比较麻烦、分辨率有限、探针不稳定、放射性同位素的危害较高等问题，故目前弃之不用。20世纪80年代用非放射性半抗原如生物素进行核酸标记的技术逐渐开展后，探针也开始使用这种非放射性标记方法。随后FISH技术逐渐开展起来，1986年以后该技术被应用于分析细胞分裂期染色体铺片的DNA序列。相对于放射性来说，FISH具有稳定性好、操作安全、结果迅速、空间定位准确、干扰信号少、一张玻片可以标记多种颜色探针等优点。这些优点逐渐使FISH成为一种研究分子细胞遗传学很好的方法。
FISH即染色体荧光原位杂交(Flourescence in situ hybridization,FISH)是通过荧光素标记的DNA探针与样本细胞核内的DNA靶序列杂交，从而获得细胞核内染色体或基因状态的信息。FISH是将传统的细胞遗传学同DNA技术相结合，开创了一门新的学科——分子细胞遗传学。（如下图所示)
二、FISH信号解读-红红绿绿是什么
目前临床上用于FISH检测的探针的荧光素大都是绿色的和橙红色标记，可大致分为：染色体计数(着丝粒)探针(centromere-enumeration probes，CEP)，位点特异性识别探针(locus-specific identifier probes，LSI)，染色体涂染(paint，WCP)探针。其中CEP和LSI探针中的计数探针、融合探针及分离重排探针，在血液病诊断与预后分型中最为常用。比如骨髓增生异常综合征(MDS)中8号染色体数目会增加;又或者多发性骨髓瘤(MM)中IGH基因的结构重排和AML-M3中的PML/RARA融合基因。检测的结果可以是扩增、缺失、融合、断裂等。
2.1 计数探针的原理
通过标记某条染色体或者是某个基因特有的特异性DNA片段，与目的基因相结合，从而产生荧光杂交信号。由于正常人的染色体是二倍体，那么正常人的检测信号就是两个，当信号多于两个或者少于两个(排除切片影响)，该染色体或者基因就异常(扩增或缺失);如下图8号染色体三体。
2.2 双色双融合探针的原理
含有用两种不同颜色荧光素标记的探针(一般用绿色和橙红色两种)，分别对应两个独立的靶基因位点，当两个独立的靶基因位点相互融合就会形成典型的两个融合信号(黄色)和一个正常的绿色信号及一个正常的红色信号;如下图慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因形成模式图。
2.3 重排探针的原理
某基因发生重排时会在相对恒定位置断开，通过不同颜色荧光素标记断裂点两端特异性的DNA片段，该基因没有发生重排，红色和绿色靠近会发生混合色形成黄色;如果发生断裂，则形成单独的颜色(如单独的红或绿)，当然，重排探针同样能够提示数目异常(如多倍体)。如下图IGH基因的重排。
注：部分图片素材来自雅培官网
三、常见的FISH临床应用有哪些
3.1 在实体肿瘤中应用
- 指导靶向药物的使用，如乳腺癌赫赛汀(HER2)、肺癌克唑替尼(ALK/ROS1/CMET);
- 指导肿瘤预后，如脑胶质瘤的预后(1p和19q缺失)、神经母细胞瘤和分化型神经母细胞瘤(NMYC)。
3.2在淋巴造血肿瘤中的应用
1.明确诊断，如急性早幼粒白血病：t(15;17)，慢性粒细胞白血病：t(9;22)，套细胞淋巴瘤：t(11;14)，Buikitt淋巴瘤：c-MYC基因重排;双打击及三打击淋巴瘤：MYC，BCL2，BCL6。
2.血液肿瘤，如急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤等进行危险分层。
表1 骨髓增生异常综合征常见FISH检测意义
表2 慢性淋巴细胞白血病中常见FISH检测意义
表3多发性骨髓瘤中常见FISH检测意义
注：欧洲骨髓瘤工作组推荐MM患者要做浆细胞CD138分选后相关FISH检查
3.检测染色体隐蔽易位或常规细胞遗传学不能发现的异常。
4.微小残留病定量和分析大量分裂和不分裂细胞，评估细胞遗传学缓解和复发（灵敏度不如实时定量PCR）。
四、FISH检测的优势是什么
FISH技术一般用于了解基因或染色体发生扩增、缺失、融合或断裂，只需分析间期细胞，每次可分析间期细胞500-1000个，不受细胞是否分裂的影响，能更好地全面判断患者某种染色体异常比例。由于使用的是特异的探针，使人为的判断误差大大减小。根据荧光信号判断结果，比染色体分析获得结果更加快速，重复性好。
参考资料
