【9.1.1】荧光原位杂交技术(FISH)

一、FISH的前世今生

在FISH技术问世之前,基于20世纪60年代,放射性核素探针的原位杂交方法,检测间期染色体和分裂期染色体上特定DNA和RNA序列的方法,该方法存在操做比较麻烦、分辨率有限、探针不稳定、放射性同位素的危害较高等问题,故目前弃之不用。20世纪80年代用非放射性半抗原如生物素进行核酸标记的技术逐渐开展后,探针也开始使用这种非放射性标记方法。随后FISH技术逐渐开展起来,1986年以后该技术被应用于分析细胞分裂期染色体铺片的DNA序列。相对于放射性来说,FISH具有稳定性好、操作安全、结果迅速、空间定位准确、干扰信号少、一张玻片可以标记多种颜色探针等优点。这些优点逐渐使FISH成为一种研究分子细胞遗传学很好的方法。

FISH即染色体荧光原位杂交(Flourescence in situ hybridization,FISH)是通过荧光素标记的DNA探针与样本细胞核内的DNA靶序列杂交,从而获得细胞核内染色体或基因状态的信息。FISH是将传统的细胞遗传学同DNA技术相结合,开创了一门新的学科——分子细胞遗传学。(如下图所示)

二、FISH信号解读-红红绿绿是什么

目前临床上用于FISH检测的探针的荧光素大都是绿色的和橙红色标记,可大致分为:染色体计数(着丝粒)探针(centromere-enumeration probes,CEP),位点特异性识别探针(locus-specific identifier probes,LSI),染色体涂染(paint,WCP)探针。其中CEP和LSI探针中的计数探针、融合探针及分离重排探针,在血液病诊断与预后分型中最为常用。比如骨髓增生异常综合征(MDS)中8号染色体数目会增加;又或者多发性骨髓瘤(MM)中IGH基因的结构重排和AML-M3中的PML/RARA融合基因。检测的结果可以是扩增、缺失、融合、断裂等。

2.1 计数探针的原理

通过标记某条染色体或者是某个基因特有的特异性DNA片段,与目的基因相结合,从而产生荧光杂交信号。由于正常人的染色体是二倍体,那么正常人的检测信号就是两个,当信号多于两个或者少于两个(排除切片影响),该染色体或者基因就异常(扩增或缺失);如下图8号染色体三体。

2.2 双色双融合探针的原理

含有用两种不同颜色荧光素标记的探针(一般用绿色和橙红色两种),分别对应两个独立的靶基因位点,当两个独立的靶基因位点相互融合就会形成典型的两个融合信号(黄色)和一个正常的绿色信号及一个正常的红色信号;如下图慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因形成模式图。

2.3 重排探针的原理

某基因发生重排时会在相对恒定位置断开,通过不同颜色荧光素标记断裂点两端特异性的DNA片段,该基因没有发生重排,红色和绿色靠近会发生混合色形成黄色;如果发生断裂,则形成单独的颜色(如单独的红或绿),当然,重排探针同样能够提示数目异常(如多倍体)。如下图IGH基因的重排。

注:部分图片素材来自雅培官网

三、常见的FISH临床应用有哪些

3.1 在实体肿瘤中应用

  1. 指导靶向药物的使用,如乳腺癌赫赛汀(HER2)、肺癌克唑替尼(ALK/ROS1/CMET);
  2. 指导肿瘤预后,如脑胶质瘤的预后(1p和19q缺失)、神经母细胞瘤和分化型神经母细胞瘤(NMYC)。

3.2在淋巴造血肿瘤中的应用

1.明确诊断,如急性早幼粒白血病:t(15;17),慢性粒细胞白血病:t(9;22),套细胞淋巴瘤:t(11;14),Buikitt淋巴瘤:c-MYC基因重排;双打击及三打击淋巴瘤:MYC,BCL2,BCL6。

2.血液肿瘤,如急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤等进行危险分层。

表1 骨髓增生异常综合征常见FISH检测意义

表2 慢性淋巴细胞白血病中常见FISH检测意义

表3多发性骨髓瘤中常见FISH检测意义

注:欧洲骨髓瘤工作组推荐MM患者要做浆细胞CD138分选后相关FISH检查

3.检测染色体隐蔽易位或常规细胞遗传学不能发现的异常。

4.微小残留病定量和分析大量分裂和不分裂细胞,评估细胞遗传学缓解和复发(灵敏度不如实时定量PCR)。

四、FISH检测的优势是什么

FISH技术一般用于了解基因或染色体发生扩增、缺失、融合或断裂,只需分析间期细胞,每次可分析间期细胞500-1000个,不受细胞是否分裂的影响,能更好地全面判断患者某种染色体异常比例。由于使用的是特异的探针,使人为的判断误差大大减小。根据荧光信号判断结果,比染色体分析获得结果更加快速,重复性好。

参考资料

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