【1.6.1.2】用于癌症免疫治疗的下一代细胞因子

免疫治疗作为当前热门的癌症治疗手段，多数研究关注的是T细胞激活的第一信号（TCR）及第二信号（CD28），作为第三信号的细胞因子尚未得到充分的研究和临床应用，具有巨大的发展潜力。然而，细胞因子在体内半衰期短和毒副作用强给相关治疗方案的开发带来了巨大的挑战。为了延长细胞因子的半衰期，增强肿瘤靶向的能力，现有的细胞因子改造方式包括将细胞因子与聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）连接、与肿瘤靶向抗体融合或降低细胞因子与细胞因子/细胞受体的亲和力。这些改造方式提高了细胞因子的抗肿瘤效果并且降低了毒性。但是为实现细胞因子精准靶向肿瘤细胞（tumor cells）、肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes）或外周免疫细胞（peripheral immune cells），仍然需要进一步修饰改造。这篇综述文章选取了临床前研究和临床应用中常见的五种细胞因子，详细阐述了延长半衰期、提高肿瘤靶向能力，进而增强抗肿瘤效果的新一代设计方式，并对细胞因子免疫疗法的发展方向做出展望。

一、I 型干扰素-α

I 型干扰素-α（IFN-α）在 DC 细胞与活化 T 细胞的交叉呈递中也起到重要作用。研究表明 IFN-α 抑制肿瘤细胞的生长、增殖、以及凋亡，已被FDA批准用于高剂量下治疗血液瘤和黑色素瘤。随着IFN-α 在癌症治疗中出现严重毒副作用，多种用于提升 IFN-α 安全性的药物被研发推出，例如聚乙二醇化的 IFN-α（PEGylated IFN-α， PEG-IFN-α）。PEG-IFN-α 可以降低与其受体的亲和力，并且延长自身半衰期，已被批准用于黑色素瘤的治疗。然而，由于体内I型干扰素受体分布十分广泛，PEG-IFN-α 在体内仍然会引起严重的毒副作用。这些研究表明缺乏肿瘤靶向的 PEG-IFN-α 限制了其在临床上的应用 （表1）。

表1. 工程化的 IFN-α

将 IFN-α 与肿瘤靶向抗体相融合可以直接将 IFN-α 富集在肿瘤微环境，从而增强抗肿瘤效果的同时降低毒性。常见的肿瘤靶点包括表皮生长因子受体（EGFR）、人表皮生长因子受体2（HER2­）、Erb-B2 受体酪氨酸激酶2（ERBB2）以及血管生成因子（VEGF）受体等。然而由于 IFN-α 受体（IFNAR）的广谱表达，可能导致肿瘤靶向抗体融合的细胞因子与非靶细胞结合而被这些细胞“劫持” ，从而削弱有效性、增强毒性。因此构建 IFN 突变体，降低其与受体结合能力，并与高亲和力的肿瘤靶向抗体融合表达后，可以进一步提高 IFN 肿瘤靶向，减少细胞因子的外周消耗，从而降低毒性，提升抗肿瘤效果。

除此之外，IFNs 还可以显著地诱导肿瘤细胞和瘤内免疫细胞 PD-L1 的表达。提示IFN肿瘤治疗可以和 PD-L1 阻断疗法联合使用，通过阻断 PD-L1 对 T 细胞的抑制，刺激更强的 T 细胞反应来对抗肿瘤的生长。研究表明，IFN-α-PD-L1 融合蛋白的靶向作用可以将 IFN 信号递送至肿瘤局部，最大化抗肿瘤反应。

二、Common γ chain 家族细胞因子：IL-2，IL-15，IL-21

2.1 IL-2

IL-2 发现于1970年代，主要由激活的 CD4+T 细胞产生。IL-2 具有很强诱导杀伤性 T 细胞和 NK 细胞的能力，因此成为了最早一批被 FDA 批准用于治疗转移性黑色素瘤和肾癌的细胞因子之一。IL-2 由于其较短的半衰期、治疗剂量下的毒副作用以及对免疫抑制细胞 Treg 的扩增，因此在临床上的应用并不广泛。目前有效的解决方案包括：

1. 将 IL-2 与免疫球蛋白的 Fc 片段或 PEG 连接以延长半衰期；
2. 将 IL-2 与抗体融合以靶向肿瘤微环境；
3. 引入 IL-2 突变以降低 IL-2 与 Treg 的结合；
4. 合成可以被肿瘤相关蛋白酶激活的药物前体形式 （表2）。

表2. 工程化的 IL-2

IL-2 的受体由 IL-2Rα、IL-2Rβ 和 IL-2Rγ 组成，Naïve CD8+T 细胞及 CD4+/CD8+ 记忆 T 细胞表达中等亲和力的 IL-2Rβ/IL-2Rγ二聚体。在有 IL-2Rα 形成三聚体时，IL-2Rα 的亲和力是最强的。而 Treg 上又高表达 IL-2Rα，因此高剂量的 IL-2 是发挥免疫正向作用的，而低剂量的 IL-2 是发挥免疫抑制的功能。

NKTR-214 是一种将 IL-2 与 PEG 连接的药物前体形式，PEG 的连接遮挡了 IL-2Rα 的结合位点，而不影响与 IL-2Rβ 的结合，并且同时延长了 IL-2 的半衰期，以此达到了提高肿瘤 CD8+T cell 与 Treg 细胞的比值，增强抗肿瘤效果的目的。当然这一设计也存在一系列问题，例如：

1. 70%的患者产生了抗 PEG 的抗体，这些抗体可能会限制 NKTR-214 的效果；
2. 缺乏肿瘤靶向的 PEG-细胞因子可能会在达到治疗剂量前就显现毒副作用；
3. PEG 的连接不具有位点特异性，这种不稳定性也会影响药物生产和临床应用。

IL-2 与 IL-2Rβ 的亲和力被突变增加后（被称为 IL-2 superkine），可以显著的扩增杀伤性 T 细胞和 NK 细胞，增强体内的抗肿瘤反应。然而，增强了 IL-2 与 IL-2Rβ 的亲和力，同样会导致外周的 NK/NKT 的扩增，从而在抗肿瘤的剂量下也显现出了强大的毒副作用。

为了将 IL-2 递送到肿瘤附近，很多设计将 IL-2 与肿瘤相关抗原（如 EpCAM，CD20，ch14.18）的抗体构建成融合蛋白，这些治疗手段由于减少了 IL-2 在外周血液中的驻留，因此提高了治疗效果，降低了毒性。然而，尽管与抗体融合，IL-2 与其受体 IL-2Rα 的高亲和力仍然会导致 IL-2 与 Treg 而不是效应 T 细胞的结合。因此，许多新的设计将重点放在了突变 IL-2 融合蛋白的构建上，例如 Merck KGaA 研发的 NHS-IL2LT 以及 Roche Pharma 研发的 CEA-IL2v。

由于 IL-2 会优先与 IL-2Rα 结合，随后与 IL-2Rβγ 结合，因此，IL-2Rα 作为天然的“面罩”可以增强 IL-2/IL-2Rα 复合物（ALKS 4230）与 IL-2Rβ 的结合。同理，其他的设计包括通过蛋白酶激活的 IL-2 药物前体形式等，蛋白酶的选取通常是肿瘤特异性的抗原或者是基质金属蛋白酶（MMP）。这种设计可以显著降低肺和肝毒性，从而将 IL-2 的活性集中在肿瘤局部。综上，这些 IL-2 的设计的目的都是提升肿瘤浸润淋巴细胞的效应，减小外周的毒性，并且对原位和转移性肿瘤提供更强的控制作用。

2.2 IL-15

IL-15 主要由单核细胞、巨噬细胞和 DC 细胞表达。从结构上来说，IL-15 优先与抗原提呈细胞（APC）上的 IL-15Rα 结合，随后反式呈递到 NK 或 T 细胞上于 IL-2/IL-15Rβ 及 common γ chain 的结合。IL-15 对 NK 细胞的发育和维持记忆 CD8+T 细胞的稳态十分重要。更重要的是，与 IL-2 相比，由于 IL-15 不结合 IL-2Rα，因此不会诱导 Treg 细胞的下游免疫抑制信号。

IL-15 的临床应用受到限制的主要原因是较短的半衰期以及较低的治疗效果。研究发现，相比 IL-15，IL-15 与 IL-15Rα sushi domain 连接形成的复合物（RLI）具有更强的抗肿瘤效果。而另一项研究将人的 IL-15 突变体与 IL15Rα sushi domain 连接，并且与 IgG1 Fc domain 融合用以延长半衰期（ALT-803），该重组蛋白已经进入临床试验。在临床 I 期试验中，19%的病人符合了临床获益标准，但是治疗效果并没有强于 DI-Leu16-IL2。另一项临床试验检测了 ALT-803 与 anti-PD-1 联合治疗转移性非小细胞肺癌的效果，然而相比免疫检查点阻断治疗，ALT-803 的联合并没有很大优势。于此同时，所有病人体内都检测到了外周血中 NK 和 CD8+T 细胞数量的增加，这表明了在治疗剂量下，IL-15 带来的毒副作用是很明显的。

2.3 IL-21

IL-21 主要由 Tfh 细胞、Th17 细胞以及 NKT 细胞表达。IL-21 的下游信号是由 IL-21R 和 common γ chain 共同介导的。IL-21R 主要由造血细胞表达，包括 T/B 细胞、NK 细胞以及髓系细胞。IL-21 具有广谱的功能，例如：促进 CD4+Th17 细胞和 Tfh 细胞的分化；辅助 NK 细胞和 CD8+T 细胞的成熟以及促进记忆CD8+T 细胞的分化。另外，与 IL-2 相反的是，IL-21 可以通过抑制 Foxp3 的表达从而抑制 Treg 的扩增。

临床 I/II 期结果显示非肿瘤靶向的 IL-21 单体在转移性黑色素瘤和肾癌的病人中有部分响应。然而，由于其极短的半衰期与外周的消耗，系统性给药往往在肿瘤微环境中达不到治疗的浓度，提高剂量又引发巨大的毒副作用，而局部瘤内给药在大多数病人中很难实现。为了解决这一难题，免疫细胞因子融合蛋白应运而生。例如，将 IL-21 与靶向肿瘤微环境中 CD8+T 细胞表面的 PD1 分子的 anti-PD1 抗体相融合。

2.4 IL-12

白细胞介素12（IL12）是由 p35 和 p40 亚基通过二硫键连接形成的异源二聚体，主要由激活的抗原提呈细胞产生。IL12 受体是由IL12Rβ1 和IL12Rβ2 两个亚基组成，主要表达在 T 细胞和 NK 细胞上。其中 IL12Rβ1 是组成型地表达在多种免疫细胞上，而 T 细胞和 NK 细胞在激活之后会上调 IL12Rβ2 的表达。IL12 能够促进激活的 T 细胞和 NK 细胞分泌一些毒性效应分子和细胞因子，主要包括 IFN-γ，来发挥抗肿瘤的作用。在临床前研究中，系统注射重组 IL12 分子能够在多种肿瘤模型中展现出显著的抗肿瘤活性。在临床研究中，IL12 分子在多种恶性肿瘤中的作用已经被深入研究，但是半衰期短、严重的副作用等问题大大限制了 IL12 在临床上的应用。频繁地系统注射 IL12 分子会诱导外周 T 细胞和 NK 细胞产生大量的促炎细胞因子，造成严重的毒副作用。因此，研究者开发多种策略来提高治疗效率的同时降低毒性。很多临床前研究使用转导 IL12 的细胞进行局部肿瘤治疗。另外一种策略就是将肿瘤靶向的抗体和 IL12 连接在一起构成融合蛋白，能提高 IL12 分子的半衰期和肿瘤靶向的能力。在多种肿瘤模型中，静脉注射肿瘤靶向抗体-IL12 融合蛋白，融合蛋白能够选择地积累到肿瘤组织。机制上，融合蛋白能够激活效应 CD8+T 细胞发挥抗肿瘤功能，更重要的是能够减少 IL12 在外周组织和血液中的滞留，降低副作用。对于原位肿瘤或者迁移的肿瘤，融合蛋白都比单独的抗体或者细胞因子具有更强的抑制作用 (表3)。

表3. 工程化的 IL-12

三、下一代细胞因子前药的前景展望

上述提到的所有改造细胞因子的目的就是在系统递送时降低毒性并提高抗肿瘤效果。对于临床上细胞因子的免疫治疗，平衡最大的治疗活性和最小的外周毒性是至关重要的。肿瘤靶向治疗可以用来解决这个问题，但正常组织上靶向抗原的潜在表达，即便很低的表达水平，也经常会导致脱靶效应。另外，所有突变的蛋白和连接的外源性蛋白的免疫原性也是普遍的问题。下一代的细胞因子前药将克服以上的问题。理想的细胞因子前药会用多肽遮盖细胞因子的活性，比如使用自然存在的细胞因子受体结合结构域，以达到最小的毒性，另外自体细胞因子受体最大程度降低外源蛋白的免疫原性。这种方法能够阻断细胞因子的活性，直至细胞因子进入肿瘤组织，因此提供了一种有效的被动肿瘤靶向效应。

参考资料

• https://mp.weixin.qq.com/s/fCQ2UaNXKJtJmeo2NUlcbw
• Next-generation cytokines for cancer immunotherapy。 https://academic.oup.com/abt/article/4/2/123/6309385