【1.1.2】质粒基本概念

一、什么是质粒

在最基本的层面上,质粒是小的环状 DNA 片段,独立于宿主的染色体 DNA 进行复制。它们 主要存在于细菌中,但也天然存在于古细菌和真核生物中,如酵母和植物。 在自然界中,质粒为宿主提供了一种或多种功能益处,例如对抗生素的抗性、降解功能和/或毒力。所有天然质粒都包含复制起点(控制质粒的宿主范围和拷贝数),并且通常包含有利于生存的基因,例如抗生素抗性基因。

相比之下,实验室中使用的质粒通常是人工的,旨在将外源 DNA 引入另一个细胞。至少,实验室创建的质粒具有复制起点、选择标记和克隆位点。质粒修饰的简便性和质粒在细胞内自我复制的能力使它们成为生命科学家或生物工程师有吸引力的工具。

质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA,是进行DNA重组的常用载体。在分子生物学实验中,通常将目的基因插入到质粒的多克隆位点上,构建新的重组质粒,目的基因可以随质粒载体进入到受体细胞中。获得高品质的质粒对下游实验起到非常重要的作用。

  • 复制原点 (ORI) 允许通过招募复制机制蛋白在质粒内启动复制的 DNA 序列
  • 抗生素抗性基因 允许选择含有质粒的细菌。
  • 多克隆位点 (MCS) 包含多个限制性位点的 DNA 短片段,可以轻松插入 DNA。在表达质粒中,MCS 通常位于启动子的下游。
  • 插入 将基因、启动子或其他 DNA 片段克隆到 MCS 中以供进一步研究。
  • 发起人区域 驱动目标基因的转录。表达载体的重要组成部分:决定基因在哪些细胞类型中表达以及获得的重组蛋白的数量。
  • 可选标记 抗生素抗性基因允许在细菌中进行选择。然而,许多质粒也具有用于其他细胞类型的可选择标记。
  • 引物结合位点 用作 PCR 扩增或测序起始点的短单链 DNA 序列。引物可用于质粒的序列验证。

二、实验室如何构建质粒?

由于其人工性质,实验室质粒通常被称为“载体”或“构建体”(“vectors” or “constructs)。要将感兴趣的基因插入载体,科学家可能会使用多种克隆方法中的一种(限制酶、不依赖连接、Gateway、Gibson 等)。该克隆方法最终选择了基于要克隆到质粒。无论如何,一旦克隆步骤完成,含有新插入基因的载体就会被转化到细菌细胞中,并在抗生素平板上选择性地生长。

重要的是,因为从中分离出质粒的细菌生长迅速,并且随着它们的生长产生更多的质粒,科学家们可以轻松地制造大量质粒以进行操作并在以后的工作中使用。

三、科学家如何使用质粒?

通常,科学家使用质粒来操纵靶细胞中的基因表达。 特性如柔软性,通用性,安全性和成本效益使分子生物学家广泛地利用在宽范围的应用的质粒。一些常见的质粒类型包括克隆质粒、表达质粒、基因敲除质粒、报告质粒、病毒质粒和基因组工程质粒。

质粒可以用来做的许多事情包括:

  • 生产大量蛋白质,以便科学家可以在受控环境中对其进行纯化和研究。
  • 产生发光的蛋白质,以便科学家可以追踪它们在细胞内的位置或数量
    • 绿色荧光蛋白 (GFP)
    • 荧光素酶
  • 监测特定环境中化学品的含量
  • 生产酶,对生物体的基因组进行特定的、可控的改变(基因组工程)
  • 生产可用于研究或治疗的合成病毒

四、常见问题

4.1 电泳检测质粒DNA常见的几种形状

一般来说提取的质粒有三种形状,电泳图从上而下分别是开环DNA、线性DNA和超螺旋DNA。假如提取的质粒污染比较严重,在电泳图上乃至还会看到宿主细胞的基因组和RNA污染。双螺旋质粒的含量是判别质粒提取作用的重要指标,双螺旋质粒的转染功率最高。在实践操作过程中,有时我们只能看到两条条带,乃至是一条,能够经过单酶切线性化质粒和原始质粒一同进行电泳,线性化条带所处的方位指示的是质粒的实践巨细,而依据相对搬迁速度,来判别另一条条带是开环质粒还是超螺旋质粒。

4.2 质粒的拷贝数由什么决议的?

质粒依据仿制特性能够分为严紧型和松懈型,

  • 严紧型质粒在宿主细胞中仅含有1-2个,它的仿制与宿主细胞染色体受相同要素的操控,在必定的细胞周期内仿制。严紧型质粒分子量较大,比如F质粒和P1质粒。
  • 而松懈型质粒在宿主细胞中含有十几个,乃至是几十个,在整个细胞成长周期中能够随时仿制。松懈型质粒分子量较小,比如pBR322(15-20copies)、ColE1(20-30copies)、pUC(30-50copies)质粒。

一般情况下,质粒的仿制数是由其仿制子(ori的品种)决议的,有时也会遭到宿主细胞的品种、细胞的培育环境的影响。

4.3 常见的低仿制质粒是严紧型质粒吗?

商业化载体简直都归于松懈型质粒,但质粒的仿制数有所不同,比如植物表达载体pBI121,载体上含有从ColE1来历的ori仿制元件,虽然也是松懈型质粒,但相对于pUC质粒来说,仿制数较低,在质粒提取时,需求较大的菌体量,取得的质粒量才能到达试验需求。pBR322也是我们常见的一款低仿制质粒,包括一个仿制起点(ori)、一个Ampicilin抗性片段(AmpR)和一个tetracycline抗性片段(TetR),能够作为载体骨架,构建各类载体。pBR322的仿制子并不是一个能诱导超高仿制才能的起点,但也能够保证每个宿主细胞包括15-20个质粒。

针对于这类质粒,能够在得到部分成长的细菌培育物中参加氯霉素继续培育若干小时,氯霉素能够抑制宿主细胞中蛋白质的合成,阻挠细菌染色体的仿制,但是松懈型质粒仍可继续仿制,在参加氯霉素的若干小时内,仿制数继续递加。

4.4 应该选择什么等级的质粒?

不同等级的质粒适合于不同的下流试验,假如下流用于酶切、测序、亚克隆、转化和基因表达等常规分子生物学试验,手提和试剂盒提取制备的质粒均能到达需求。假如下流需求将质粒转染至细胞中或许显微注射到试验动物体内,则要求质粒的内毒素含量和超螺旋比例到达必定的标准。内毒素会影响质粒的转染功率和转染后细胞状况,质粒超螺旋比例越高,其转染功率及表达量也会越高。

参考资料

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