【1.1.4】甘油冻存菌、引物、质粒的保存
一、甘油冻存菌的保存与复苏
1.1 简介
按照菌种类型(如DH5α或者表达菌)的不同，分盒保存。冻存盒中的冻存管，可按冻存时间排列。冻存菌保存在-80℃冰箱或液氮罐中。
1.2 材料（MATERIALS）
- 50%（v/v）灭菌甘油
- 2 mL 无菌冻存管
- 1 mL已灭菌的枪头
- 无菌接种环或灭菌枪头，含有合适抗生素或无抗的LB板
1.3 实验步骤（PROCEDURE）
甘油菌的冻存：
一般保种用的菌液要求浓一些，因此培养时间可以比平时长一些，一般过夜即可; 在无菌操作条件下，分别向已灭菌的2mL冻存管中，加入500uL菌液和500uL 50%甘油溶液，轻轻混匀，务必充分混匀; 甘油冻存菌可以直接保存在-80℃中，有时为了减少菌体因冰晶形成而死亡，也会使用液氮速冻之后在放到-80℃冰箱保存。该冻存菌可在此条件下保存数年之久。随后的冻存和融化操作将会减少保存年限。 （注意：与菌液接触的物品，如枪头、冻存管、50%甘油溶液均需要处于无菌状态，并保证操作在无菌条件下进行。）
甘油菌的复苏：
从甘油冻存菌中复苏细菌，在无菌条件下，打开盖子，使用无菌接种环或灭菌枪头从冻存管中刮取适量冻存菌，划线接种到LB板（含有合适抗生素或无抗）上。操作应适当快一些，以减少冻存管内的融化。 在合适的温度条件下，将划线接种的LB板进行过夜培养。过夜培养后，挑取单个克隆进行后续操作。 （注意：所有东西准备完全后，再去-80℃冰箱取出保种菌，划线动作要快，时间拖得太长会融化冻存菌，而这导致保种菌死亡。）
二、引物保存
2.1 简介
按照用途，引物分为PCR引物，测序引物。而按照存在状态，引物则分为干粉/薄膜状态、100 uM稀释状态、10 uM稀释状态（10 uM为PCR的通常使用浓度）等三种状态。
2.2 材料（MATERIALS）
- 1.5 mL EP管
- 无菌蒸馏水
2.3 实验步骤（PROCEDURE）
引物一般有两管（均为干粉状态），其中一管可直接保存，而另外一管可稀释其中引物的浓度至10uM（使用浓度）。两管放置可在同一个冻存盒中的相邻位置，按引物序号排列。
PCR引物则根据引物的浓度不同（一般只有100uM和10uM两种）进行分盒保存。在每一个冻存盒中，按照引物序号依次排列。引物保存在-20℃冰箱中。
引物稀释：
先将装有引物的EP管进行离心，12000g 离心1 分钟，将干粉或薄膜状态的引物离心至管底。然后，根据引物管上指示的体积，加入对应量的无菌蒸馏水，使用枪头吹打混匀，即可得到浓度为100uM的引物。对其进行10倍稀释，即可得到浓度为10uM的引物。
三、质粒保存
3.1 简介
按照用途，质粒一般分为PCR模板型质粒（用于扩增目的基因片段）和蛋白表达型质粒（用于表达目的蛋白）。可按照用途的不同，分盒保存。经常使用的质粒可以保存在-20℃冰箱中，长期保存建议放在-80℃冰箱。
对于新构建的质粒或者购买回来的载体，建议测序正确后再多提几管，放在-80℃冰箱保存。
此外，还可以将质粒转入合适的感受态菌株中，通过保存菌种的方法达到保存质粒的目的。
3.2 质粒中基因组污染是怎样发生的？
基因组污染一般是因为操作过于剧烈发生的，假如为了进步混合作用，选用涡旋振荡的方法来进行混匀，基因组DNA会被剪成小片段，在中和过程中被复性，保留在上清中随质粒DNA一同被回收。所以在质粒提取过程中，动作要尽量温和。
3.3 为什么有些质粒，纯化后长时间放置会降解？
发生这种现象的主要原因是核酸酶污染，除了在制备时简单引进外源核酸酶之外，质粒宿主细胞也会影响抽提质量，JM系列细胞中含有丰富的核酸酶活性，假如制备的质粒需求长时间保存，主张替换宿主细胞，如DH5α、XL1-Blue，用于抽进步质量质粒。
3.4 之前测序没问题的菌液，37℃扩大培育后，质粒的巨细或序列出现异常？
这种情况一般出现在大质粒或较特别的序列中，可能是在大肠杆菌中仿制时发生了重组，能够替换重组酶缺失的菌株，比如JM109、sure菌株，使质粒仿制愈加安稳。
参考资料
