【5.1.2.1】层析

层析在蛋白质分离纯化中是不可替代的一种方法，早在1903年，层析法就被俄国植物学家Mikhail Tswett 用来分离植物色素，因此又称为色谱。所有的层析系统都由两相组成：一个是固定相（stationary phase），它可以是固体物质，也可以是固定在固体物质上的成分；另一个是由可以流动的物质组成的流动相（mobile phase），如水和各种溶剂。当待分离样品随着流动相通过固定相时，各组分在理化性质上的差别使得各自与两相发生相互作用（如吸附、溶解或结合等）的能力不同，最终导致它们在两相中的分配不同，而且随着流动相向前移动，各组分会不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时受到的阻力就越小，向前移动的速度越快；反之，与固定相相互作用越强的组分，向前移动速度越慢。经过分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到分离各组分的目的。

常见的层析方法有：离子交换层析（ion exchange chromatography）、疏水层析（hydrophobic interaction chromatography，HIC）、亲和层析（affinity chromatography）、凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）。

1）离子交换层析

离子交换层析是以含有带电基团的树脂作固定相，利用它与流动相中带相反电荷的离子结合并进行可逆交换的性质来分离目标带电分子的一种方法。如果进行可逆交换的离子是阳离子，则为阳离子交换层析；反之，则称为阴离子交换层析。在进行离子交换层析时，首先需要用几倍于柱体积的低盐缓冲溶液对树脂进行平衡；然后在低盐条件下，将样品上柱，与树脂带相反电荷的分子会通过静电作用与树脂结合，而不带电荷的或带相同电荷的分子直接流出最；后，用高盐缓冲溶液洗脱，以取代与树脂结合的分子。

2）疏水作用层析

疏水作用层析是利用不同蛋白质在疏水性质上的差别，而对特定蛋白质进行纯化的一项层析技术。其固定相是连接到惰性基质上的疏水基团，如苯环。其原理类似于盐析，即在高离子强度下样品上柱（如1 mol·L-1硫酸铵），以此除去蛋白质的水化层，因而表面上亲水基因最少的蛋白质最容易失去水，也就最容易暴露出它们的疏水基团，并与树脂上的疏水基团结合；反之，表面上亲水基团最多的蛋白质最难失去水化层，也就最难与固定相结合。

HIC的洗脱方法有：降低洗脱液的盐浓度、增加洗脱液的去污剂浓度或者改变pH。

3）凝胶过滤层析

凝胶过滤层析又称分子筛过滤层析（molecular sieve chromatography）或大小排阻层析（size exclusion chromatography）等，是一种按大小来分离物质（分子形状也起一定作用）的层析方法。其固定相是装在层析柱内细而多孔的凝胶颗粒，如葡聚糖（Sephadex），在将样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱以后，使用缓冲液洗脱。大分子无法进入凝胶颗粒的内部，只能存在于凝胶颗粒之间的流动相，因而以较短的路径和较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒内部，并很快在两相之间形成动态平衡，于是要走更长的路径和花费更长的时间流过柱床，不同大小的分子因此得以分离。

4）亲和层析

亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异性的亲和力，而实现分离的一类特殊层析技术。其固定相是惰性的带有共价偶联配体的树脂，当含有混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相上的配体具有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其他没有亲和力的无关组分就随流动相流出。如果改变流动相成份，可将结合的亲和物洗脱下来。洗脱的方法有：增加游离配体的浓度或改变pH。

可用于亲和层析的具有特异性亲和力的生物分子对（蛋白质-配体）主要有：酶与底物/抑制剂；受体与激素；抗体与抗原；抗体与蛋白质A；带有His标签的融合蛋白与金属镍；带有GST标签的融合蛋白与谷胱甘肽；蛋白质与染料；糖蛋白与植物凝集素（lectin）；其他特异性结合蛋白与被结合的物质。

亲和层析纯化过程简单、迅速、高效，有时能够“一柱到位”，对分离含量极少又不稳定的活性物质特别有效。

参考资料

• 南京大学 杨荣武老师 《结构生物学》课件