【6.8.4.1】重组DNA技术中常用的工具酶
在重组DNA技术中，常需要一些基本工具酶进行基因操作。例如，对目的基因进行处理时，须利用序列特异性的限制性核酸内切酶在准确的位置切割DNA，使较大的分子成为一定大小的DNA片段。构建重组DNA分子时，必须在DNA连接酶的作用下，才能使目的基因片段与载体连接。此外，还有一些工具酶也是重组DNA时必不可少的。先将某些常用工具酶概括于下表：
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限制性核酸内切酶： 识别DNA特定序列，切断DNA链
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耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)： 聚合酶链反应(PCR)
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DNA连接酶：连接两个DNA分子或片段
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多核苷酸激酶 ： 催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化，制备末端标记探针
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末端转移酶 ： 在3’末端加入同聚尾
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碱性磷酸酶： 切除核酸末端磷酸基
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S1核酸酶、绿豆核酸酶： 降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变为平端
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DNA酶Ⅰ ：降解DNA，在双链DNA上产生随机切口
RNA酶A ： 降解除去RNA
反转录酶： 催化以单链RNA为模板生成DNA反应的酶，称反转录酶。
- 合成cDNA
- 替代DNA聚合酶I进行填补、标记或DNA序列分析
DNA聚合酶I或其大片段(Klenow)
- 缺口平移制作标记DNA探针
- 合成cDNA的第二链
- 填补双链DNA的3’凹端
- DNA序列分析
下面，我们重点介绍再基因重组中最重要的限制性核酸内切酶和DNA连接酶。
一、限制性核酸内切酶
(一)、核酸酶概念与分类：
核酸酶分为两类：
- 核酸外切酶(exonuclease)是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；
- 核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3'-5’磷酸二酯键，将核酸链切断。
很多细菌和细胞都能识别外来的核酸并将其分解，1962年发现这是由于细菌中含有特异的核酸内切酶，能识别特异的核酸序列而将核酸切断；同时在细菌体内还伴有特定的核酸修饰酶，最常见的是甲基化酶(methlase),能使细胞自身核酸特定序列上的碱基甲基化，从而避免受内切酶水解，外来核酸没有这种特异的甲基化修饰，就会被细胞的核酸酶所水解。这样细胞就构成了限制-修饰体系(restriction modification system)，其功能就是保护自身的DNA，分解外来的DNA，以保护和维护自身遗传信息的稳定，这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。这就是限制性内切酶中“限制”二字概念的由来。
(二)、限制性核酸内切酶的概念与分类
限制性核酸内切酶是一类专门切割DNA的酶，它们能特异的结合一段被称为是限制性内切酶识别序列的DNA序列，并切割双链DNA。
限制性核酸内切酶可分为3种类型。Ⅰ型和Ⅲ型限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰(甲基化)作用及依赖ATP的限制(切割)活性。
Ⅲ型限制酶在识别位点上切割DNA，然后从底物上解离。
Ⅰ型限制酶的切割位点与识别位点不一致，它结合与识别位点，但却随机的切割回转到被结合酶处的DNA，在分子克隆中，Ⅰ型和Ⅲ型限制酶都不常用。
Ⅱ型限制-修饰系统是由两种酶分子组成的二元系统：一种为限制酶，它识别和切割某一特异性的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。迄今人们已分离出大量的Ⅱ型限制酶，其中许多已应用于分子克隆中。这一节我们主要介绍Ⅱ型限制酶。每一种Ⅱ型限制酶的识别序列都有其特定的核苷酸序列，因此只要知道DNA的序列，就可以找出限制酶的识别位点，并可计算出酶切后DNA片段的长度(以核苷酸对或碱基对的数目表示)。
(三)、限制性内切酶的作用特点
1.限制酶识别位点
(1)一般特征：Ⅱ型限制酶所识别的特殊的DNA序列亦称为限制酶识别位点或酶切位点，一般长度为4个、5个或6个核苷酸对，且成二重对称结构。
有少数限制酶识别更长的序列或简并序列。
(2)简并序列：简并序列是指序列中有的核苷酸位点可以是不同的核苷酸。如，GTYRAC(HindⅡ)，其中Y=C或T，R=G或A,YR可以是CG、CA、TG或TA。所以HindⅡ实际上可识别4个特定的序列。
(3)与切割位点不同的识别位点：有些限制酶的切割位点是在识别位点的附近。如，Hgal的识别位点是GACGC(5/10)，在两条DNA链上切割位点分别距识别位点5个和10个核苷酸。
2.限制酶的切割位点
限制酶在识别位点切割DNA时，其具体的切割位点(磷酸二酯键断开的位点)相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶刚好在对称轴处同时切断DNA的两条链，产生带平头末端的DNA片段；另一些酶则在对称轴两侧类似的位置分别切断两条链，产生带有单链突出的粘性末端的DNA片段。有6个核苷酸对组成的限制酶识别位点，不同的酶对各自位点切割时可以产生5种不同的断裂方式。
点击后看大图 3.同裂酶(isoschizomer)
通常，不同的限制酶有不同的识别序列，然而有许多不同来源的限制酶切割DNA后产生相同的末端，这些酶就是同裂酶。同裂酶有3种类型。
(1)同功异源：不同来源的限制酶可以切割同一靶序列。如MboI和Sau3AⅠ均可以切割以下靶序列：
(2)一个位点包含在另一个位点之中：一些酶识别4核苷酸序列，这种核苷酸序列包含在另一些酶的6核苷酸识别序列中。例如MboⅠ和Sau3AⅠ位点与BamHⅠ位点即具有这种特点。
(3)两位点切割后的断裂末端相同：有些酶识别的完整序列不完全一样，但切割位点间的序列一样。如:
末端相同，可交叉连接，这在DNA重组时是非常有用的。
二、DNA聚合酶
DNA聚合酶以DNA为模板合成DNA。在基因工程中常用的有以下几种：
(一)大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
是由一条多肽链组成，分子量为109kD，具有三种活性，即5'-3’DNA聚合酶活性，5'-3’及3'-5’外切核酸酶活性，同时它还具有RNA酶H的活性。RNA酶H的活性是大肠杆菌细胞存在所必需的，但在分子克隆中未用到此活性。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ在分子生物学实验中常用于：1.缺口平移制作标记DNA探针；2.合成cDNA的第二链；3.填补双链DNA的3’凹端。
(二)大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow片段)
大肠杆菌DNA聚合酶I用枯草杆菌素(subtilin)处理后，可以产生大小不同的两个片段。其中大片段称为Klenow片段(由Klenow等人于1970年报道)。该片段仅具有5'-3’DNA聚合酶活性及3'-5’外切核酸酶活性。Klenow片段在分子生物学实验中常用于：1.补平限制酶切割DNA产生的5’突出的粘性末端；2.对5’突出的粘性末端进行末端标记；3.合成cDNA的第二链。
(三)T7噬菌体DNA聚合酶
T7噬菌体感染大肠杆菌诱生的DNA聚合酶是两种紧密结合的蛋白质的复合体，这两种蛋白质一个是T7噬菌体基因蛋白，另一个是宿主菌的硫氧环蛋白。这个复合物是所有已知DNA聚合酶中持续合成能力最强的一个。T7噬菌体DNA聚合酶所催化合成的DNA的平均长度比其他DNA聚合酶催化合成的DNA的平均长度大很多，在DNA序列测定时具有很大的优势。T7噬菌体DNA聚合酶没有5'-3’外切核酸酶活性，但其3'-5’外切核酸酶活性非常强。通过基因工程手段生产出一种经过改造的T7噬菌体DNA聚合酶，它完全丧失了外切核酸酶的活性，其商品名为测序酶，是目前DNA序列测定中最常用的酶。
(四)Taq DNA聚合酶
是一种耐热的DNA聚合酶，适用于PCR。最佳作用温度为75-80℃。于60℃时聚合酶活性仅剩50%，于37℃时聚合酶活性仅剩10%。在较低温度下开始缓慢聚合反应，可以避免引物从模板上解离。
三、逆转录酶
逆转录酶或称反转录酶(reverse transcriptase)是依赖于RNA的DNA聚合酶，即以RNA为模板合成DNA。但实际上，也可以单链DNA为模板合成DNA。
商品化的反转录酶有两种，一种是从禽成髓细胞瘤病毒(AWV)的病毒颗粒纯化而得到的禽源逆转录酶；另一种是鼠源逆转录酶，是将Moloney鼠白血病病毒(MMLV,或Mo-MLV)的逆转录酶的基因克隆后，在大肠杆菌中分离得到的。鼠源逆转录酶较为常用。
四、DNA连接酶
DNA连接酶催化DNA5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键而将DNA片段连接起来。在基因工程中最常用的是T4噬菌体DNA连接酶。
五、核酸酶
常用的核酸酶有S1核酸酶(nuclease S1)。
S1核酸酶
S1核酸酶可降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或寡核苷酸，双链DNA及DNA-RNA杂交体对此酶相对不敏感。然而如果所用得酶量非常大，则双链核酸可被完全消化。中等量的S1核酸酶可在切口(nick)或小缺口(small gaps)处切割双链DNA。S1核酸酶可用于去除DNA片段突出的单链尾，以产生平末端，也可用于切开双链cDNA合成中产生的发夹环。
S1核酸酶是从米曲霉(aspergill suoryzae) 中提取的。S1核酸酶是一种特异性单链核苷酸内切酶。能降解单链DNA 和单链RNA，产生5'- 单链核苷酸或寡核苷酸。双链DNA、双链RNA 和DNA-RNA 杂交分子对S1核酸酶具有较大的抵抗力，只有高浓度的酶才可使其消化。它水解单链DNA 的速率要比水解双链DNA快75 000 倍。酶反应的最适PH 为4.0~4.3,pH4.9 时酶活性下降50%。
六、末端转移酶（terminal transferase）
核糖核酸酶 V1 (RNase V1) 是在里海眼镜蛇 (Naja oxiana) 的毒液中发现的一种核糖核酸酶。 [1] 它以非序列特异性方式切割双链 RNA，通常需要至少六个堆叠核苷酸的底物。 [2] 像许多核糖核酸酶一样，这种酶需要镁离子的存在才能发挥活性。 [3]
参考资料
