【5.7.2】酶联免疫吸附技术(ELISA)

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一、原理

如公式三所示，如果我们需要测量KD，我们需要测量动态平衡以后溶液中游离的R的浓度，游离的L的浓度和R-L复合物的浓度。这无疑是一个复杂的检测过程，在实际的应用过程中经过公式推导和假设以后转变成以下公式，如下图所示即少量R存在的情况下，将L进行梯度稀释，检测R-L复合物的浓度，当R-L复合物的浓度占总R浓度的一半时，L对应的浓度值（EC50）即L相对于R的KD值。只有在此在特定的实验条件下EC50值能够等价于KD值。动态平衡测定法测定KD值有几个关键点，即相互作用的两个分子，R要少量，L要进行连续的梯度稀释，得到平台期最大的信号响应值（所有的R的结合位点被L占据），那么在此条件下，占据一半R时，所需要的L浓度（EC50）为KD值。利用此方法进行KD测量的方式多样，往往会对L进行标记，等R-L形成动态平衡后，利用物理手段去除未反应的L后测得的标记的L的信号值能够完全代表R-L复合物。

具体的实验方法有同位素标记测定，偏振荧光测定，流式细胞术进行测定，ELISA进行测定等多种方法。这样的测量对于R的浓度和纯度没有要求，只要相对少量，如流式测量方法的R往往是细胞携带的，Cell-Based ELISA方法中受体的提供者也是细胞，但是对于L是需要比较纯度和精确浓度，因其浓度是直接和KD对应的。

二、实验

免疫标记技术(immunolabeling technique)是指用荧光素、酶、放射性同位 素等对抗体或抗原进行标记，然后再通过检测标记物来推断抗原抗体反应的实验 技术。

实验一 酶联免疫吸附技术(ELISA)–双抗体夹心法测定 AFP

enzyme linked immunosorbent assay

[目的]

  1. 掌握酶联免疫吸附技术的基本原理。
  2. 熟悉双抗体夹心法测定甲胎蛋白(AFP)的方法。

[原理]

酶联免疫吸附技术(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)是一种 集 免疫学、生物化学及光学检测技术为一体的测定方法。将抗体固定化后，加 入标 本，再加入酶标抗体，形成抗体-抗原-抗体复合物，再加入酶反应的底物 后，底 物被酶催化形成产物，再加入显色剂即成为有色产物，产物颜色的深浅 与标本中 抗原物质的量呈正相关，由此进行定性或定量分析。

[材料]

  1. AFP 诊断试剂盒。
  2. AFP 阳性品，阴性对照品，待检品。
  3. 微量加样器，温箱。

[方法]

  1. 将包被孔编号，分别加入阳性对照、阴性对照及待测样品各 50ul。
  2. 在各孔内加入酶结合物 1滴，37°C温育 30分钟。
  3. 甩掉孔内液体，然后在各孔中分别加入洗涤液 1滴，摇匀，弃去，用蒸 馏 水或自来水加满各孔甩掉，反复 5次，然后在吸水纸上吸干(倒扣在吸水 纸上)。
  4. 各孔内加入底物和显色液各 1滴，轻轻摇动混匀，室温避光反应 2- 5min， 观察结果。

[实验结果]

  1. 若待检孔显色浅于或等于阴性对照孔则判定为阴性。
  2. 若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为阳性。
  3. 若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔则判定为弱阳性。

[注意事项]

  1. 加样应加在加样孔的底部，避免产生气泡，防止产生假阴性。
  2. 洗涤必须彻底，防止产生假阳性。

[思考题]

  1. 免疫标记技术的特点是什么?
  2. 目前临床上 ELISA 实验用于哪些分子的检测?

实验二 免疫金标记技术 –妊娠诊断试纸检测 hCG

[实验目的]

掌握免疫金标记技术的基本原理和结果判定。

[实验原理]

免疫金标记技术(Immunogold labelling techique)是将金颗粒标记抗原或 抗体，用于检测相应抗体或抗原的一种实验方法。该技术主要利用了金颗粒具有 高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标 记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或 半定量的快速免疫检测。

####[实验器材]

早早孕检测试纸条，HCG 阴性对照品，待检品。

####[实验方法]

  1. 待测样品、检测试纸和其它检测材料等在室温后检测。
  2. 将测试纸有箭头的一端插入尿液标本容器中，5 秒钟后取出平放，5 分钟 内观察结果。

[实验结果]

  1. 阳性:在检测线位置和对照线位置各出现一条红色反应线。
  2. 阴性:仅在对照线位置出现一条红色反应线。
  3. 无效:测试纸无红色反应线出现，或仅在检测线位置出项一条反应线，表 明实验失败或测试纸失效。

[注意事项]

试纸条插入尿液深度不可超过 MAX标志线。

[思考题]

  1. 育龄妇女，停经 3天，早早孕试纸条检测阳性，临床上应首先考虑何种 情况?
  2. 流产后，早早孕试纸条检测阳性，临床上应首先考虑何种情况?

四、应用案例

ELISA 法是继免疫荧光和放射免疫技术之后出现的免疫酶技术，通过将可溶性的抗体或抗原分子结合到固相载体上，然后利用抗原-抗体特异性结合特性的免疫反应进行定性或定量的分析方法［31-32］。在抗肿瘤类单抗药物质量控制过程中，ELISA 法可用于分析蛋白A 残留、宿主细胞蛋白残留，细胞竞争性或配体竞争性ELISA 法可用于单抗类药物生物学活性的分析。采用竞争抑制ELISA法发现抗血管内皮生长因子165 ( VEGF165) 单抗VG2 抑制VEGF 与受体结合，提示VG2 单抗能够抑制VEGF 引起的人脐静脉内皮细胞( HUVEC) 的增殖，即竞争抑制ELISA 方法可作为VG2 单抗生物学活性质量评价的手段［33］。宋媛媛等［34］成功建立了基于ELISA 法进行人血清中重组人鼠嵌合型抗CD20 单克隆抗体注射液( SCT400) 和利妥昔单抗免疫原性分析和药物浓度检测方法，并成功运用于临床试验样本的免疫原性检测。另外，采用ELISA 定量检测方法分析抗CD52 单克隆抗体中残留蛋白A的定量限为0.16 ng·mL-1，蛋白A 的加标回收率均处于80%~120%，即ELISA 定量检测方法检测抗CD52 单抗中蛋白A 残留量的专属性、准确度、精密度和线性均良好［35］。但ELISA 法用于单抗类抗肿瘤药物质量分析时也存在一定的局限性，如需经过孵育和洗涤等多步操作、容易受到外源或内源性物质的干扰，检测依赖高亲和力和高特异性的高品质单克隆抗体试剂等。已有的证据显示不同的单抗类药物与脱落的蛋白A 的结合程度不同［36］，需要根据不同单抗产品特性进行相关的研究，建立适合于特定单克隆抗体的蛋白A 残留ELISA 检测方法。

参考资料

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