【5.5】流式细胞荧光分选技术FACS
FACS（Fluorescence activated Cell Sorting）
一、基本概念
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细胞的分选是指根据所测定的各个参数将指定的细胞从细胞群体中分离出来的一种方式，通过分离含有单细胞的液滴实现。
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在流动室的喷口上方配有一个超高频的压电晶体，产生的振动使喷出的液流形成均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。
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将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离
我们首先来看看流式细胞术的简单介绍：
流式细胞术：是基于细胞或颗粒光学散射特点和荧光信号差异对单个细胞或颗粒进行统计分析的一种检测方法。
流式抗体：与普通抗体的不同，是偶联荧光素的抗体.表达某一抗原的细胞与偶联荧光素的抗体特异性结合，经过流式细胞仪检测区时荧光素被激光激发，发射出的荧光信号被接收。分析时反推回去：某种荧光信号→某种流式抗体→某种抗原→某种细胞。
流式图：流式仪将接收到的光信号转化为电信号，经计算机转化为数字信号，绘制成图呈现。
流式通道主要可以分为散射光通道和荧光通道散射光通道有两个，包括FSC通道和SSC通道。
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FSC,即前向角散射，它的值代表细胞的大小。细胞体积越大，其FSC值就越大。所以可以利用细胞的FSC值初步比较细胞的大小，利用FSC值对细胞进行分群和分类。
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SSC,即侧向角散射，它的值代表细胞的颗粒度，细胞越不规则，细胞表面的突起越多，其SSC值就越大。所以可以利用细胞的SSC值初步比较细胞的颗粒度，利用SSC值对细胞进行分群和分类。
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一般在研究细胞样品时，首先关注的就是样品中细胞的FSC-SSC散点图，x轴代表FSC值，y轴代表SSC值，可以初步根据细胞的大小和颗粒度对细胞进行分群和分类，样品细胞不需要标记任何荧光素偶联抗体。
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荧光通道可以检测样品中是否有细胞表达某一CD分子，这需要标记荧光素偶联的该CD分子的抗体，表达有该CD分子的细胞会结合荧光素偶联抗体，其中的荧光素被相应的激光激发后产生荧光，该荧光信号通过光路系统被相应的荧光通道接收，就能得到该样品中是否有细胞表达该CD分子，以及有多少比例的细胞表达该CD分子等信号，因此可根据荧光信号的强弱判断细胞表达该CD分子的数量。
二、结果图介绍
2.1 直方图（Histograms）
流式直方图的x轴表示一种通道值，y轴表示细胞数量，根据通道值与细胞个数之间的关系对细胞进行分群。如图，x轴为FSC通道值，y轴为细胞个数，FSC代表细胞大小的程度，图中显示有两个峰，由此可知，根据细胞大小的不同，可把细胞分为两个群。
- 横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，可以是线性或对数坐标。
- 纵坐标一般是相对细胞数。
直方图适用于分析处理周期（如下图）
直方图分析数据注意事项：
① 不能比较不同标记之间的表达量。如一号样本单标记CD133、二号样本单标记CD44，那么CD133与CD44表达量不能用直方图进行比较。
② 直方图的形状（直方图的高度及宽度）取决于仪器的类型、处理软件和样本
③检测目的细胞非常少（即检测的细胞在一个细胞群体中所占的比例特别少），因此需要统计大量的数据，直方图将会将该稀有细胞覆盖，如下图散点图中的P2门为CD16阴性群体，但在直方图中则几乎看不出来，所以此时散点图为最佳展示数据方式。
2.2 散点图（Dot plots）
流式直方图只能表示一个通道的信息，而流式散点图能够同时表示两个通道的信息。流式散点图也是采取坐标轴的方式，x轴表示一个通道的值，y轴表示另一个通道的值，图中每一点代表一个细胞，该点所对应的横坐标值就是该点所代表细胞的x轴通道的值，所对应的纵坐标值就是该点所代表细胞的y轴通道的值，它具有易于细胞分群、分类，以及确定比例关系等优点。
这时还需要理解一个概念——门。在流式分析时不希望所有样品细胞都显示于流式图中，而是希望只显示感兴趣的细胞，排除其他细胞的干扰，这时会设定一定规则，只有符合规则的细胞才能留下，进行下一步分析，不符合的被去除，如图3-4，A图是SSC和FSC两种通道值绘制的散点图，把细胞分为两个群，选取其中一个群的细胞（A图圆圈内），进行下一步分析，如图B中根据CD19-PE、CD3-FITC两种荧光通道值，对A图中圈内细胞进行分析，B图中画了十字线，该线是根据两种荧光的的强度，把图内细胞分为四群，计算机会给出各群内细胞所占的比例，其他图以此类推。
散点图是双变量图的基本图形，相对于单参数直方图其分析通量更高，同时也能更好观察到较小比例细胞群，参见直方图注意事项2，另外散点图中设门后，可以赋予门控颜色，便于观察门控细胞群在其他图中的分布，比如下图只赋予淋巴细胞门红色，则可以观察到淋巴细胞中在散射光图中的分布。
横坐标和纵坐标都是光信号，十字门左下角是双阴性群，右下角和左上角是单阳群，右上角是双阳群。散点图上的每一个点可以代表某一个细胞的信息。
显示足够多events下的细胞分群上缺乏细节，如下图，流式仪器记录的events达到50000以上时，CCR7的阳性群与阴性群已经没有明显界限，但当用等高线图或者密度图时，明显改善点图存在的缺点
2.3 密度图（Density plot）
密度图不仅能够表示一个标记的表达水平，还能显示给定区域中事件的相对数量（密度）。有三种密度图。密度度、斑马线图、伪彩图。选择自己一种喜欢的应用
2.4.等高线图（Contour plots）
等高线图是另一显示数据密度的形式。该图使用等高线显示数据的相对强度。等高线的每条线包含events的百分比由所用软件的等高线图决定。单纯的等高线图不能显示低密度的群体颗粒或者异常值，最好的策略为等高线图与点图结合起来使用，比如下图左边为点图，中间为等高线图，左边为等高线加点图。
2.4 分析，建议用散点图
用直方图不能说错，但这需要在没有自发荧光或自发荧光低、荧光渗漏调整到位的情况下。而在实际检测中，自发荧光总是难以避免，更不用说现在多色流式中荧光渗漏对通道的干扰。
摘录 https://slideplayer.com/slide/13482960/ 中的图与大家剖析，通过下面这个图可以明显看出，在直方图上，自发荧光造成的拖尾，使得你的阴阳性分界位置难以确定，即使GFP样本能够形成双峰，但实际上双峰分界位置同时包括了自发荧光假阳性信号、阳性群弱表达信号，这两部分信号数量一样的时候，这个位置恰好相互抵消，但如果不一样的，这个比例就不准确了，如果改用下面的散点图，用不规则门（如下面的梯形门），就可以准确圈出阳性群，呈现更真实的比例：
参考资料
