【5.2.3.7】凝胶过滤层析

凝胶过滤又称为分子筛及体积排阻,体积排阻层析是根据蛋白质具有不同的水力学半径将它们进行分离,该数据主要通过测量分子尺寸和形状两方面信息获得。与上述其他层析过程不同的是,蛋白质不与SEC的固定相相结合,而是依靠它们通过惰性固定相的速度不同来完成分离。

图 9. 三种不同水力学半径的蛋白质混合物用体积排阻色谱柱分离。

大蛋白因为不能进入介质孔道内部而只能直接流经柱体最先流出。稍小的蛋白质会进入介质孔道内部,流经的路径更复杂,因此需要更多的时间来穿过介质并流出柱体

基于SEC可分辨不同种类蛋白的能力,它通常是一种用于最后一步纯化的有效方法。低聚物 、去折叠的蛋白分子和缺失蛋白都可以在逐渐置换缓冲液的过程中与结构完整的天然蛋白质分子分离开。通常,由于SEC可使用溶剂种类更多,所用的缓冲盐也更少,因此比透析的缓冲液置换过程更快也更可靠。整个SEC过程都只使用一种溶剂,而市购的SEC固定相几乎与所有常规的缓冲液兼容。

固定相的类型和柱子的长度对蛋白质的SEC分离的分辨率有很大的影响。市场上有很多种固定相可选,其选择最好是根据待分离蛋白质分子的分子量和分离条件两方面来决定。

与其他层析方法一样,SEC同样既有优点也有缺点。是否采用SEC要取决于蛋白质本身及其后续应用的要求。

SEC的优点:

  1. 可进行缓冲液交换和脱盐。
  2. 可分离其他纯化技术难以分离的相似品种(如蛋白片段和低聚物)。
  3. 可与多种溶剂相容。
  4. 不依赖于蛋白质的任何一种特殊形式进行保留和洗脱。

SEC的缺点:

  1. 分离效果严重依赖柱子的填装效果。
  2. 蛋白质与介质间有非特异性相互作用,会降低分辨率。
  3. 对复杂的蛋白质混合物分辨率低。
  4. 为保证足够的分辨率,上样量必须较小。这对沉淀得到的高浓度蛋白质是一个问题。

要优化SEC条件以获得最好的分离效果,常常需要耗费大量时间,而一些因素会对分离效果产生非常大的影响。

提高SEC分离效果的条件:

  1. 上样体积尽量最小。上样体积越小,洗脱组分的扩散将会越弱。
  2. 缓冲液中加盐。少量的盐有助于防止蛋白质与固定相间的非特异性相互作用。这将保证所有的蛋白质可以稳定地流过整个层析柱。
  3. 采用合适的流速。流速过快使得小分子没有足够的时间流经介质孔道,流速过慢则会导致样品扩散时间增加。
  4. 保证样品和溶剂的黏度接近。调整样品的条件使其与洗脱缓冲液的类似。
  5. 调整层析柱长度。柱子过短使蛋白质分离不充分。而柱子过长则使得蛋白质样品扩散严重。
  6. 重装柱子。柱子的填装效果会蛋白质的分离效果有相当大的影响。

如果介质颗粒没有分布均匀或者填装时带入气泡,蛋白质将不能顺利地流过固定相。此外,如果柱子跑干了,就必须重装。柱子填装不好通常就是分离效果不好的原因。

由于SEC并不是基于蛋白质官能团间的相互作用来进行分离,所有的蛋白质都在相同的条件下进行洗脱,所以分离效果仅仅依赖于蛋白质各自不同的水力学半径。因此,SEC通常不适合在含有较多杂蛋白的纯化工艺前期使用。但是,SEC又可作为一种快速可靠的样品脱盐或者小分子去除方法用于分离工艺前或中期。在纯化的最后阶段,当只剩痕量杂蛋白时,SEC则是一种蛋白质分离和置换保存缓冲液的有效方法。

参考

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