【7.6.1.】HPLC法
用于单抗类抗肿瘤产品的分析的HPLC 方法主要有反向-超高效液相色谱法( reverse phage-ultra high performance liquid chromatography，ＲP-UHPLC) 、体积排阻色谱( size exclusion high performance liquid chromatography，SEC-HPLC) 、阳离子交换高效液相色谱( cation exchange high performance liquid chromatography，CEX-HPLC) 、离子交换高效液相色谱( ion exchange-high performance liquid chromatography，IEC-HPLC) 和荧光检测器-高效液相色谱仪( fluorescence detector HPLC，FLD-HPLC) 等［21-24］。
三、应用
肽图谱分析是通过蛋白酶或其他化学物质对蛋白质进行裂解后采用适宜的方法对蛋白质的一级结构的完整性和准确性进行鉴别的手段。胰蛋白酶水解联合ＲP-HPLC 或ＲP-UHPLC 是《中华人民共和国药典》收载的用于生物制品肽图检查的方法之一，也是抗肿瘤类单抗鉴别的重要参数。另外，高效液相色谱-质谱联用技术鉴定蛋白质一级结构准确度高，也用于分析单抗类产品的肽图。SEC-HPLC法是分析单抗分子大小异质性的主要手段，能够全面反映单体、单抗聚体和残体等的信息，是单抗类产品纯度和杂质质量控制的重要方法。IEC-HPLC 可用于分析单克隆抗体抗肿瘤药物中不同电荷异构体的比例，与cIEF 手段结合可有效分析单抗类抗肿瘤药物的酸性峰、碱性峰和主峰。CEX-HPLC 属于离子交换色谱范畴，主要用来分析等电点为弱碱性单抗药物的电荷异质性。有研究发现，CEX-HPLC 可以有效分离重组人源化抗白细胞分化抗原52( cluster of differentiation 52，CD52) 单克隆抗体的酸性、中性及碱性电荷变异体，且专属性、线性、准确性、精密度和耐用性良好［25］。将人乳头瘤病毒( human papilloma virus，HPV) 18 型L1 抗原用胰蛋白酶水解后的肽段用反向液相色谱( ＲP-HPLC) 法分离得到抗原肽图，并采用HPLC-MS /MS 肽图特征峰分析可对不同企业生产的18 型的HPV L1 抗原进行鉴别与质量控制［26］。郭莎等［27］通过采用SEC-HPLC 可有效分析单体的峰面积，采用IEC-HPLC 可有效检测酸性区峰面积、主峰峰面积、碱性区峰面积，并以此建立了抗PD-L1 单抗的多种质控方法。在建立抗白细胞分化抗原38( cluster of differentiation 38，CD38)单克隆抗体关键质量属性质控方法时也证实SECHPLC 分析可用于CD38 纯度控制［28］。采用HPLC-肽图法对抗人CD52 单抗的专属性鉴别时也证实辅料制剂和异种抗体对CD52 单抗的检测结果无干扰，且HPLC-肽图适于CD52 单克隆抗体的专属性鉴别、质量控制和产品批放行［29］。同时，在建立PD-1 单克隆抗体关键质量指标质控方法时也发现SEC-HPLC 法、ＲP-HPLC 法及CEX-HPLC 法可进行PD-1 单克隆抗体单体的纯度、单体和聚合体含量、电荷变异体分析，这些方法是PD-1 单克隆抗体制品常规质量控制的有效方法［30］。
参考资料
