【8.4.6】PsTag
蛋白质和多肽已成功用作高效治疗剂已有近三十年的历史了。通过肾脏过滤从血液循环中快速清除是除抗体和疫苗以外的大多数蛋白质和肽共有的典型特性。提高治疗性蛋白质的体内生物半衰期（t1 / 2）的一项既定策略是生物成分与合成聚合物聚乙二醇（PEG）的化学偶联（Jain and Jain，2008; Pasut and Veronese，2012）。然而，这种PEG化具有若干缺点，包括商业PEG衍生物的费用以及体外共价偶联至蛋白质或肽所需的额外纯化步骤，因此降低了产率并增加了成本。此外，PEG具有一些潜在的安全风险，例如抗PEG的抗体的产生以及PEG的生物降解性非常有限，这会引起副作用，例如肾上皮的空泡化（Knop等，2010; Veronese等，2009 ）
尽管存在这些问题，但聚乙二醇化已被证明具有生物有效性，并已产生11种FDA批准的治疗剂（Zhang等人，2014）。 在这里，我们描述了一种新型的重组多肽，具有聚乙二醇化的优点，但没有缺陷。 Tis多肽是一种亲水性，不带电荷且无结构的生物聚合物，其生物物理特性与PEG非常相似（图1）。 已知将已知治疗性蛋白质和多肽与构象紊乱的多肽序列进行基因融合，可以作为扩展血浆t1 / 2的潜在策略，而无需对融合产物进行化学或翻译后修饰（Kontermann，2011； Kontermann，2012） ）
迄今为止，所有非结构化多肽都被设计为改变物理大小和电荷，以延迟肾脏滤过（Kontermann，2012； Hu等，2015）。这些方法大多数都产生高度免疫原性的产物或仅适度延长t1 / 2（Alvarez等人，2004； Schlapschy等人，2007； MacEwan和Chilkoti，2010）。更先进的重组肽聚合物技术最引人注目的例子是XTEN，它包含六个氨基酸（A，E，G，P，S和T）（Schellenberger等，2009）。 XTEN在864个残基的XTEN序列中包含144个Glu残基，导致XTEN融合蛋白具有较高的总体负电荷和非常低的等电点（pI）值。这种方法利用了来自带负电荷的肾小球基底膜的排斥力，由于内皮细胞带负电荷的糖萼，导致血浆t1 / 2的增加以及融合药物的组织穿透性降低。但是，后者是有问题的，因为大多数生物药物仅在进入间隙和下层组织后才发挥最大的治疗作用。另外，静电排斥倾向于降低药物的结合，因为大多数药物受体在带负电荷的细胞表面表达，这降低了药物的功效。一种不同的方法，PASylation技术，基于三种氨基酸（P，A和S），由XL-蛋白质（Schlapschy等人，2013）建立。通过仅连接一个杂交的寡脱氧核苷酸构件（编码20个氨基酸），合成了长PAS编码基因盒。因此，由于长结构单元的重复，PAS聚合物具有确定的序列。
在我们的方法中，使用五个氨基酸（P，S，T，A和G），我们生成了包含可重复序列的短肽段文库。通过一系列筛选过程，我们获得了不同长度的新型不带电重组多肽，其生物物理特性与PEG高度相似，因此将其称为PsTag。为了评估与PsTag序列融合的效用和特性，我们选择了人FGF21（一种FGF家族的独特成员）进行了广泛研究，认为其具有治疗糖尿病和肥胖症的潜力（Kharitonenkov等，2005； Zhang和李，2014）。天然FGF21的血浆t1 / 2非常短，取决于给药途径和种类，从0.5至5小时不等。因此，有效的体内生物活性需要频繁注射或连续输注天然蛋白（Smith等人，2013），并且在使用天然FGF21作为治疗性蛋白方面将构成重大挑战。由于已经开发了长效FGF21类似物的变体，降低了几组的给药频率（Gimeno和Moller，2014年），我们预计将PsTag与FGF21融合会产生具有改善的药代动力学和药效学性质的蛋白质。长效FGF21类似物已被广泛评估用于糖尿病的治疗（Huang等，2011； Hecht等，2012）。我们使用高脂饮食（HFD）诱导的肥胖（DIO）小鼠和瘦小鼠评估了我们的融合产品，希望能够对一系列相关药效学参数进行更广泛的测量。
设计 PsTag序列
在设计具有PEG类特性的新型重组多肽时，例如大的流体动力学体积，高溶解度和缺乏电荷，我们首先排除了疏水氨基酸（F，I，L，M，V，W和Y） 引起聚集，并可能引发HLA / MHC-II介导的免疫反应。 还排除了半胱氨酸残基（由于可能的交联），带电荷的氨基酸（H，K，R，E和D）以及N和Q的酰胺侧链，它们很容易水解。因此，只有五个 都非常亲水的氨基酸（P，S，T，A和G）保留为构件肽的可能成分
为了在大肠杆菌中创建遗传稳定，高度表达的非结构化多肽，我们生成了一个包含10个氨基酸的片段的文库，该文库包含随机序列（每个片段均包含2P，3S，2T，1A和2G）。值得注意的是，这些氨基酸的均聚物均具有一定的二级结构偏好性：例如，A的α-螺旋，P和T的β-sheet和G和S的β-turn。但是，我们认为氨基酸序列中P，S，T，A和G的组合可能会抵消其独特的构象偏好，这可能会导致多肽稳定失调。设计10个氨基酸的文库有几个原则：
- 首先，相同的氨基酸必须被其他两个氨基酸分隔开，从而避免重复相同的氨基酸以形成稳定的二级结构。
- 其次，10个氨基酸片段中的五个氨基酸（P，S，T，A和G）的组成比例受其亲水性影响。
- 最后，然后评估随机序列的标准，例如mRNA二级结构，肽二级结构和蛋白质消化。
基于这些原则，设计了一个10个氨基酸的片段库以供进一步研究（支持信息表S1）。然后，针对大肠杆菌中的荧光强度，筛选编码与GFP融合的包含10个氨基酸区段的随机序列的合成基因文库。换句话说，通过连接杂交的10个氨基酸片段的寡脱氧核苷酸构件来合成长PsTag基因。因此，这些区段的连接构成了PsTag多肽。因为这种连接是一种随机过程，所以这些片段可能是可重复的。在文库中选择了编码多达600个残基的PsTag聚合物，并在大肠杆菌中成功生产。
参考资料
- 2016 ，Genetic fusion of human FGF21 to a synthetic polypeptide improves pharmacokinetics and pharmacodynamics in a mouse model of obesity
