【5.6.2】体积排阻色谱法SEC
体积排阻色谱法 (SEC) 是液相色谱的一种主要分离模式，近年来被广泛地应用在各个行业，是研究分子量及分子量分布测试、研究聚合物分子结构，揭示聚合物类样品物理性能的重要表针手段。在聚合物类产品质量的控制、合成工艺的改进过程中发挥着积极作用。
如图一所示，体积排阻色谱法（SEC）的原理是由于样品中各组分的分子量大小不同，有的组分可以进入孔中，停留时间相对较长，有的组分无法进入，停留时间短；通过选择合适孔径的色谱柱，进而对各组分进行分离。
一、基本介绍
排阻色谱法(size exclusion chromatography，SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。又称为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等，是液相色谱的一种。
1.1 体积排阻色谱柱应用
1.1 分类
1、凝胶过滤色谱法-GFC
一般用于分离水溶性的大分子，凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。
2、凝胶渗透色谱法-GPC
主要用于有机溶剂中可溶的高聚物相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
凝胶本身具有三维网状结构，大分子在通过这种网状结构上的孔隙时被排阻，小分子通过时被滞留。分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队”，凝胶表现分子筛效应。
1.2 排阻色谱不适用范围
1、分子直径比最大孔隙直径大的分子全部被排阻在凝胶颗粒以外，叫做全排除，两种或两种以上的这样的分子不能达到分离效果。
2、直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒内部，这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离效果。
1.3 两种排阻色谱类型比较
| - | 凝胶渗透色谱（GPC） | 凝胶过滤色谱（GFC） |
|---|---|---|
| 流动相 | 采用水溶液或缓冲液作为流动相 | 采用有机溶剂作为流动相 |
| 常用分析物质 | 分析高聚物的摩尔质量，如：聚乙烯、聚氯乙烯等 | 多肽、蛋白质、核酸、多糖等 |
| 常用凝胶 | 交联聚苯乙烯凝胶 | 葡萄糖系列 |
| 优点 | 操作简便，进样量小，重现性好，自动化程度高 | 条件温和，产品回收率近100%，易实施循环操作，提高产品纯度，分析速度快，精度高，分离机理简单，操作参数少。 |
| 缺点 | 质脆易碎，柱子装填不紧，柱效低。 | 选择性低，料液处理量小，洗脱后产品被稀释 |
1.4 固定相与流动相
流动相的选择
- 必须能溶解样品，与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。
- 溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂限制分子扩散作用。
- 常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。
固定相（凝胶）
一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体，含有大量液体(一般是水)，柔软而富于弹性。
分类：
- 按机械强度可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。
- 按化学性质分为有机凝胶（均匀凝胶、半均匀凝胶、非均匀凝胶）；无机凝胶（非均匀凝胶）。
1.5 凝胶过滤介质
常用的是葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖以及亲脂性凝胶。
1.5.1 葡聚糖凝胶
葡聚糖凝胶是常用凝胶，由葡聚糖和交联剂甘油通过醚桥相互交联而形成的多孔性网状结构。
由于分子内含有大量羟基而具有极性，在水和其他极性溶剂如乙二醇、二甲亚砜等中溶胀成凝胶颗粒，因醚键的不活泼性，故具有较高的稳定性。
交联度大的孔隙小，吸液膨胀也少，可用于小分子物质的分离。交联度小的孔隙大，吸液膨胀也大，适用于大分子物质的分离。
1.5.2 聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，干燥粉碎或加工成形制成粒状。适合蛋白和多糖的纯化。
1.5.3 琼脂糖凝胶
琼脂糖凝胶依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌法处理。它的优点是分子量的适用范围宽。
1.5.4 亲脂性凝胶
亲脂性凝胶用于一些难溶于水或有一定程度亲脂性的样品。
（1）聚苯乙烯凝胶：应用范围广，由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成。机械性能好，孔隙分布比较宽，多应用于合成高分子材料的分离和分析。
（2）葡聚糖凝胶LH-20：是葡聚糖凝胶G-25分子中引入羟丙基以代替羟基的氢，成醚键结合状态，因而具备了一定的亲脂性，适用于分离黄酮、色素等有机物。
（3）无机凝胶：无机凝胶分为多孔性硅胶和多孔性玻璃，机械性能好，选择性高。但其吸附性较大，处理极性大的样品需注意。
1.6 凝胶特性参数
（1）排阻极限（exclusion limit): 指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。
（2）分级范围（fractionation range): 即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。
（3）溶胀率： 某些市售的干燥凝胶颗粒（如Sephadex G系列），使用前要用水溶液进行溶胀处理，溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分率称为溶胀率，即
（4）凝胶粒径： 一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，分离效率越高。软凝胶粒径较大，一般为50～150um，硬凝胶粒径较小，一般为5～50um。
（5）床体积（bed volume） 即1g干燥凝胶溶胀后所占的体积。
（6）孔隙体积（void volume) 指层析柱中凝胶之间孔隙的体积，即V0值。孔隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定。
1.7 凝胶的选择
良好的凝胶过滤介质应满足如下要求：
（1）亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用；
（2）稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长；
（3）具有一定的孔径分布范围；
（4）机械强度高，允许较高的操作压力。
二、影响分离特性的因素
2.1 填料
分离度和蛋白质的分离范围以及最小分子量之比是选择填料要考虑的首要问题。
2.2 柱长
排阻色谱的分离度与柱长的平方根成正比，一般柱长60-120cm对于蛋白质的分离比较理想，而30cm的柱子多用于快速分离。
体积排阻色谱柱选择
图三列出了不同孔径的体积排阻色谱柱适用的蛋白及水溶性聚合物的分子量分离范围，有助于针对具体样品选择最合适的色谱柱孔径。
2.3 流速
流速是影响分离的重要因素。一般流速低，分离效果好。如流速在小于0.1ml/min时，蛋白质的分离度好；在 0.5-1.0ml/min时，对于7.5mm直径的柱子，分离效率较高。
2.4 样品容量
进样体积和样品浓度将明显影响到分离度。高浓度、小体积对分离有利。合适的蛋白质样品浓度范围一般在0.01-0.5%，样品体积是柱体积的1-3%。
三、常见问题
3.1 保存及清洗方法
SEC色谱柱的保存：日常使用中，Sepax SEC色谱柱建议保存在150mM磷酸盐缓冲液中(pH7.0)。如长期不用时，可将色谱柱保存至20%乙醇中，以防止菌体污染。(注：可根据具体使用条件选择保存方式，如实验条件为缓冲盐体系，建议保存在150mM磷酸盐缓冲液中，pH 7.0。若实验条件为有机溶剂体系，建议保存在20%乙醇中。)
SEC色谱柱的清洗：多次使用后某些样品可能会吸附到入口筛板或填料上，当积累至一定程度时会出现压力升高并伴随峰型展宽的现象，此时需要清洗色谱柱。一般流程为：断开检测器，反接色谱柱，在低于50%最大推荐流速下用清洗液冲洗10-15倍柱体积。推荐清洗溶液有：
- 0.5 M硫酸钠溶液(pH 3.0)：适用于碱性蛋白的清洗；
- 10%-20%有机溶剂(乙醇、异丙醇、乙腈)：疏水性蛋白的清洗；
- 4 M尿素(pH 7.0)：适用于易聚集蛋白样品的清洗。
图四为客户用ZenixTMSEC-150做某蛋白酶样品，进样300针后柱效下降，用4M尿素清洗前后对比。
图五为客户用SRT®SEC-500长期使用含高浓度的SDS流动相后，柱效下降，分离度变差，用20%乙醇清洗前后对比。
3.2 对于易吸附样品改善峰型方法
日常使用中，我们经常会碰到一些比较棘手的样品，有些带电荷的样品可能会与色谱柱填料发生离子型吸附，有些样品可能会与色谱柱填料有疏水性吸附，这些作用都会导致色谱峰展宽，拖尾，分离度较差等问题。
Column: Zenix-C 300 ( 3 µm, 300 Å,7.8 x 300 mm)
Mobile phase: as indication
Flow rate: 0.5 mL/min;
Detector: UV 214 nm;
Column temperature: 25 ℃;
Injection volume: 10 µL;
Sample: 1 mg/mL fusion protein, MW 170 kD, pI 6.8-7.0
如图六所示，在流动相中加入高盐，如NaCl、Na2SO4、NaClO4等，适合与色谱柱填料有离子型吸附作用的样品，对于改善峰型效果显著。
Column: Zenix-C 300 ( 3 µm, 300 Å, 7.8 x 300 mm )
Flow rate: 0.8 mL/min
Detector: UV 280 nm
Column temperature: Room temperature
Injection volume: 10 µL
Sample: 3.3 mg/mL PEG-Peptide in water
图七表明在流动相中加入适当比例的有机溶剂，如乙腈、异丙醇、盐酸胍等，可降低PEG修饰蛋白与基质间的疏水性吸附作用，改善峰形。
Column: Zenix-300, Zenix-C 300 ( 3 µm, 300 Å, 7.8 x300 mm)
Mobile phase: 150 mM PB (pH 7.0) + 0.2M NaCl;
Flow rate: 0.5 mL/min; Detector: UV 214 nm;
Column temperature: 25 ℃;
Injection volume: 10 µL;
Sample: 1 mg/mL fusion protein, MW 170 kD, pI 6.8-7.0
如图八所示，选择-C 系列色谱柱，可将蛋白与基质间的吸附降到最低。
参考资料
