【5.8.3】热力学测量
在研究蛋白质结构和功能时,必须测量各种物理量,包括:
- 热稳定性和化学稳定性 thermal and chemical stability
- 与配体的结合亲和力 binding affinity to a ligand
- 溶解度 solubility
- 动态性和灵活性 dynamics and flexibility
- 反应 reactivity
人们想仅从结构中预测热力学性质
当两个相互作用的分子在水中聚集在一起时:
- 溶剂分子从结合表面释放出来 solvent molecules are released from the binding surface
- 溶质分子形成键(氢键、范德华接触等)
- 例如,预测所有焓和熵变化并将其制成表格
一、稳定性
常见的蛋白质工程目标之一是稳定蛋白质,同时保持其功能
- 稳定性的提高意味着保质期更长,避免了特殊处理,例如:冷藏或自然干燥,使传播蛋白质药物的便宜而有效成为可能
- 易于维护和处理(无冻干的人类生长激素使用前需要复溶)
- 可能需要化学修饰或定点诱变
高溶解度和抗降解性(蛋白水解)很重要
结构完整性可以通过光谱(CD、荧光),流体动力学和色谱法 进行监测
二、热稳定性和化学稳定性 Thermal and chemical stability
在蛋白质工程过程中通常使用热/化学稳定性的测量,用于监测突变影响和设计质量
注意:核心定义不清的蛋白质可能具有极高的稳定性
Bryson et al, Protein Sci 7, 1404 (1998)
二、化学变性
添加变性试剂,如尿素和盐酸胍 (GdnHCl) 可以改变折叠状态和未折叠状态之间的平衡
两者都破坏了蛋白质内的氢键网络以及蛋白质-溶剂的相互作用,从而破坏了折叠结构的稳定性
- 变性机制尚不完全清楚
- 参见 Bennion and Daggett, PNAS 100, 5142 (2003)
部分由于其净电荷,GdnHCl在诱导蛋白质变性方面的效率约为尿素的两倍(即在大约一半的浓度下展开蛋白质)
三、色氨酸荧光
荧光是在波长 λa 处吸收光并随后在波长 λe 处发射光
色氨酸荧光(λa~278和λe~348 nm)用于研究蛋白质构象(即三级结构)
荧光的精确λ和强度在很大程度上取决于吲哚周围的局部环境
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在所有三个区域都需要足够的数据点:
- 前、后和过渡需
要确保达到平衡
- 可能需要很长时间(>小时)
- 过渡过程中最慢
- 反转实验方向应产生相同的曲线
四、热变性
4.1 差示扫描量热法(DSC)
DSC可以通过计算将温度升高固定量所需的热量来测量样品的热容:
Cp= △Q/△G
当蛋白质变性时,其热容增加,导致Cp发生正变化
或者,如果没有量热计,可以估计∆Cp
Cp ≈ 172 + 17.6N -164*(# of SS)
五、结合亲和力
六、Surface plasmon resonance (Biacore)
参考资料
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