【9.6.1.3】3' UTR 在做什么

众所周知，信使 RNA (mRNA) 的 3' 非翻译区 (3' UTR) 可调节基于 mRNA 的过程，例如 mRNA 定位、mRNA 稳定性和翻译。此外，3’UTRs 可以建立 3’UTR 介导的蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI)，从而可以将 3’UTRs 中编码的遗传信息传递给蛋白质。该功能已被证明可调节多种蛋白质特征，包括蛋白质复合物形成或翻译后修饰，但也有望改变蛋白质构象。因此，3' UTR 介导的信息传递可以调节氨基酸序列中未编码的蛋白质特征。

一、前言

遗传信息存储在 DNA 中，并通过信使 RNA (mRNA) 传递给蛋白质 ( Crick 1958 )。多年来，人们认为从 DNA 到蛋白质的信息传递完全是通过将 mRNA 的编码区翻译成蛋白质的氨基酸而发生的。尽管众所周知 mRNA 在其 5' 和 3' 末端也包含非翻译区 (UTR)，但普遍的观点是这些区域在很大程度上调节 mRNA 定位或蛋白质丰度，无论是通过调节 mRNA 的翻译还是稳定性。

有了这种以蛋白质为中心的观点，令人惊讶的是，人类基因组和更简单的真核生物的基因组中蛋白质编码基因的数量相似（Lander et al. 2001 ; Mayr 2017）。此外，不同生物体的蛋白质大小在很大程度上相似（Milo 和 Phillips 2016）。这表明蛋白质序列的显着保守性并揭示了作用于蛋白质的巨大限制。 然而，它也引出了一个问题，即是什么使高等生物的生物复杂性成为可能。在这种情况下，有趣的是，<font color=‘‘red>在高等生物的进化过程中，3’ UTRs 占据的序列空间已经大大扩展，并且与生物体的细胞复杂性相关（Chen et al. 2012 ; Mayr 2016）。 重要的是，有 3’ UTR 区域从几个到几百个核苷酸 (nt)，通常是高度保守的 ( Siepel 等人 2005 ; Xie 等人 2005）。进化过程中 3’UTR 序列的扩展，以及最近发现存储在 3’UTR 中的遗传信息也可以通过 3’UTR 介导的蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 的形成传递给蛋白质（Berkovits 和 Mayr 2015），表明3’UTR可能在调节生物复杂性中起重要作用。如果是这样，为什么 3' UTR 不是每个人关注的焦点？

1. 一个促成因素是缺乏合适且稳健的方法来研究 3' UTR 功能，因为实验方法的可用性通常对进展和发现至关重要。与转录或翻译调控或microRNA（miRNA）介导的转录后调控的研究相比，3’UTRs的miRNA非依赖性功能的研究远远落后。
2. 3' UTR 的大多数功能由 RNA 结合蛋白 (RBP) 介导。但是，与 miRNA 靶位点相比，许多 RBP 的结合基序仍然未知（Baltz 等人 2012；Ray 等人 2013；Dominguez 等人 2018）。即使它们是已知的，清晰的功能效果通常也需要motifs 多次出现。由于基序通常分布在很远的距离，因此使用缺失突变体通常无法识别功能基序（Besse et al. 2009 ; Kristjansdottir et al. 2015 ; Ma and Mayr 2018）。此外，许多 RBP 与相同的基序结合（Ray et al. 2013 ; Dominguez et al. 2018），通常不知道它们是竞争还是合作（Hennig and Sattler 2015）。
3. 最后，超过一半的人类基因使用选择性切割和多聚腺苷酸化来产生仅在 3' UTR 不同的 mRNA 异构体。Lianoglou 等人。2013 年）。这使得对 3' UTR 同种型特异性功能的研究具有挑战性，因为从替代 3’UTR 同种型产生的蛋白质的氨基酸序列是相同的。

这篇综述总结了过去 25 年来对 3' UTR 函数的研究是如何进行的，学到了什么，以及将来如何解决。与 3' UTR 生物学相关的几个主题正在本集中的其他地方进行审查，包括 miRNA 的调节、RNA 编辑、RNA 结构、RBP 的识别和 RNA-蛋白质相互作用。此外，最近审查了 3' UTR 的几个“非规范”功能，此处未包括（Mayr 2017）。因此，这篇综述并不全面，而是试图集中在实验方法和概念上，以展示如何通过 3’UTR 完成调节

二. 包含 AU-RICH 元素的 3' UTRS 调节 mRNA 稳定性

核苷酸测序是在 1970 年代开发的，揭示了编码区和多腺苷酸化信号之间存在非翻译序列。掌握了来自不同生物基因的 DNA 序列，可以进行第一次比较基因组分析（Needleman 和 Wunsch 1970）。由于碱基替换率反映了功能约束的程度，因此对远距离生物的序列差异的评估允许评估功能输入的特定元素。尽管这些早期的比较基因组分析发现非翻译区的碱基取代程度高于编码区，但它们也揭示了 3' UTR 中高度的序列同源性（Miyata 等人 1980）。早期，最有趣的发现之一是编码肌动蛋白的同源基因的 3’UTR 序列在生物体中高度保守，但当比较具有不同功能或组织分布的相似肌动蛋白同种型时，3’UTR 序列高度不同。Yaffe 等人，1985 年）。高保守性表明3’UTR具有重要的调节作用，另一方面，同工型3’UTR序列的差异表明3’UTR包含额外的遗传信息以区分高度相似的蛋白质的功能。

通过研究c-fos基因的转化能力，发现了 3' UTR 包含特定功能元件的第一个迹象（ Miller 等人 1984）。尽管病毒fos ( v-fos ) 基因能够在培养物中转化成纤维细胞，但细胞fos ( c-fos ) 缺乏此功能。有趣的是，功能差异并不是两种 fos 蛋白氨基酸序列略有不同的结果。相反，当 3' UTR 被省略时，c-fos也可以转化成纤维细胞 ( Miller et al. 1984）。

• 这一发现激发了对负责任的 3' UTR顺式元件的搜索，并导致发现富含 AU 的元件，这些元件被发现会破坏 mRNAs ( Meijlink et al. 1985 )。
• 通过将顺式元件转移到其他稳定的异源 mRNA β-肌动蛋白mRNA（Shaw 和 Kamen 1986），获得了该功能的证据。
• 大约在同一时间，人们注意到富含 AU 的元素主要存在于某一类基因的 3’UTRs 中，这些基因编码短寿命因子，包括细胞因子、淋巴因子、生长因子和癌基因 ( Caput et al. 1986）。有趣的是，富含 AU 的元素有时比这些早期反应基因的编码区更保守（Shaw 和 Kamen 1986）。

然而，与富含 AU 的元素结合的反式作用因子的鉴定花费了很多年，并且仍在进行中（Ray 等人 2013；Dominguez 等人 2018）。此外，富金元素诱导的 mRNA 衰变的机制在很久以后才得到阐明，如下所述。

三、 3' UTR 调节 mRNA 定位

在发现富含 AU 的元素时，3' UTR 也被确定为亚细胞 mRNA 定位的重要调节因子。早期关于 mRNA 定位调节的研究主要在苍蝇或青蛙卵母细胞中进行。但是 mRNA 定位不仅在生殖细胞和早期发育中是必不可少的，因为它也发生在其他极化细胞中，包括成纤维细胞、成肌细胞和神经元（Lawrence 和 Singer 1986；Melton 1987）。然而，生殖细胞和发育的早期阶段对于 RNA 研究特别有利，因为早期动物发育中的基因调控依赖于胚胎转录开始之前来自卵母细胞的母体沉积的 mRNA。例如，果蝇的前体模式主要由bicoid基因的蛋白质产物指定，因为含有破坏基因的突变体没有头部和胸部（Macdonald 和 Struhl 1988）。Bicoid 蛋白主要定位于果蝇胚胎的前极并产生蛋白质梯度。由于 bicoid 是一种转录因子，它驱动大量下游基因的表达。重要的是，胚胎中的梯度取决于bicoid mRNA 先前定位到卵母细胞前极的位置。RNA原位杂交揭示了bicoid mRNA在卵母细胞和早期胚胎前极的亚细胞定位。为了鉴定负责任的 顺式元件，使用转基因果蝇测试了缺失构建体。早期果蝇胚胎前极和后极的 RNase 保护分析表明，一个 630 nt 片段的bicoid 3' UTR 对于亚细胞 mRNA 定位是必要和充分的（Macdonald 和 Struhl 1988）。

四、 3' UTR 调节 mRNA 的翻译

mRNA 定位允许对蛋白质生产进行空间和时间调节。在神经元中，众所周知，3' UTR 可调节树突和突触中的局部蛋白质合成（Miller 等人 2002；An 等人 2008；Martin 和 Ephrussi 2009）。但是，除了蛋白质生产的空间组织外，3' UTR 也是时间蛋白质生产的重要调节器。发现 3' UTR 调节翻译的初步观察结果是果蝇卵母细胞中oskar mRNA 和蛋白质表达之间的差异。oskar mRNA 决定后飞体模式 ( Ephrussi et al. 1991 ; Kim-Ha et al. 1993）。尽管oskar mRNA 在整个卵子发生过程中都存在，但只有在oskar mRNA 定位到后极后才能检测到 oskar 蛋白（Kim-Ha 等人 1995）。紫外线 (UV) 交联试验确定 RBP Bruno 是翻译调节的负责因素。Bruno 与oskar mRNA 的结合防止了 oskar 蛋白的过早翻译，并且是 oskar 在正确发育阶段表达所必需的，因为oskar mRNA 仅在到达卵母细胞的后极后才被翻译（Kim-Ha 等人 1995）。oskar翻译抑制的确切机制Bruno 的 mRNA 很晚才被阐明（Chekulaeva et al. 2006）。

五、 RBP 与 3' UTR顺式- 元素结合并调节多个且经常相反的 3' UTR 功能

最初，富含 AU 的元素被认为是 mRNA 衰变元素。然后，它们被证明也抑制翻译（Shaw and Kamen 1986 ; Kruys et al. 1989）。之后，发现富含 AU 的元素也可以增加蛋白质产量（Lindstein et al. 1989 ; Kontoyiannis et al. 1999）。例如，在静止的免疫细胞中，富含 AU 的元件抑制翻译，但在 T 细胞的脂多糖 (LPS) 刺激后，它们是快速诱导蛋白质表达所必需的 ( Lindstein et al. 1989 ; Kontoyiannis et al. 1999 )。这导致了这样一种观念，即不是cis元素本身，而是特定的结合反式作用因子决定了特定 3' UTR顺式元件的功能。

这种调节原理通过在小鼠中删除 62-nt 长、保守的富含 AU 的肿瘤坏死因子 (TNF)-α 元素很好地显示了 ( Kontoyiannis 等人 1999 )。重要的是，保留了 TNF-α 表达的剩余基因调控，因为保留了内源启动子和多腺苷酸化信号。独联体缺失-调节性富含 AU 的元素导致炎症性关节炎和炎症性肠病，小鼠在 5 至 12 周时死亡。在未受刺激的条件下，富含 AU 的元素会破坏 mRNAs 的稳定性。富含 AU 的 TNF-α 元素在非造血细胞中永久抑制翻译，在造血细胞中短暂抑制翻译。重要的是，它们的功能不仅是抑制性的，因为在被 LPS 激活后，它们最初会增加造血细胞中的 mRNA 稳定性和翻译，而在后期，它们会变得抑制性。总之，发现富含 AU 的元件是重要的调节元件，可以通过快速的开关来快速和高度动态地调节蛋白质的产生。Kontoyiannis 等人。1999 年）。

目前有超过 10 种已知的 RBP 与富含 AU 的元素结合（Brennan 和 Steitz 2001；Chen 等人 2001；Barreau 等人 2005；Lebedeva 等人 2011）。

1. Tristetraprolin (TTP) 或 KHSRP 的结合通过募集降解 mRNA 的外泌体复合物导致不稳定（Chen 等人 2001；Lykke-Andersen 和 Wagner 2005）。
2. 相比之下，HuR 的结合稳定了富含 AU 的 mRNA，可能是因为它无法募集外泌体 ( Chen et al. 2001 )。

这些发现揭示了 3' UTR 功能的一个重要调控概念：RBP 与 3' UTR顺式结合-元件并作为募集效应蛋白的衔接子。募集的效应蛋白负责观察到的效果（图1A）。RBP 的衔接功能至关重要，因为效应蛋白不能直接与富含 AU 的 mRNA 结合（Chen et al. 2001）。

3' 非翻译区 (UTR) 的功能。RNA 结合蛋白 (RBP) 与 3' UTR 结合并募集决定 3' UTR 功能的多种效应蛋白。（一）3’UTR在信使RNA（mRNA）水平上调节过程。RBP（红色、橙色）与 mRNA（浅绿色）的 3' UTR 结合并募集多种效应蛋白。外泌体（蓝色）的募集导致 mRNA 不稳定（左图），而运动蛋白（蓝色）的募集导致使用微管上的运动调节 mRNA 定位（灰线；右图）。（乙) 3' UTR 通过介导 3' UTR 依赖的蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 来调节蛋白质特征。尽管编码具有相同氨基酸序列的蛋白质，替代 3' UTR 可以确定替代蛋白质功能。这是由仅由长 3’UTR 同种型（右图）而不是短 3’UTR 同种型（左图）介导的 3’UTR 依赖性 PPI 引起的。与 3' UTR 结合的 RBP 以及募集的效应蛋白采用颜色编码，如A中所示。( C) 3' UTRs 通过介导 3' UTR 依赖性 PPI 调节不同的蛋白质特征。这可导致 3' UTR 依赖性蛋白质复合物形成、3' UTR 依赖性翻译后修饰 (P) 和 3' UTR 依赖性蛋白质折叠。

3' UTR 元件可以在不同信号通路活跃的环境中实现相反的效果。这可能是由于改变了与相同顺式元素结合的 RBP 的相对丰度或活性造成的。因此，特定 3' UTR顺式元件的功能是“上下文”相关的，因为 RBP 之间的竞争和合作将最终决定特定 3' UTR 的功能结果（Mayr 2017）。

同样，单个 RBP 可以在不同的发展阶段完成不同的功能。在早期开发中，翻译主要通过 poly(A) 尾长进行调节，该尾长由 RBP CPEB（细胞质多聚腺苷酸化元件 [CPE] 结合蛋白）决定（Richter 2007）。与 CPE 结合的 CPEB 可以调节 mRNA 多腺苷酸化、去腺苷酸化和翻译。CPEB 通过绑定几个不同的因素来实现这些功能。它同时与去腺苷酶多聚 (A) 特异性核糖核酸酶 (PARN) 和多聚 (A) 聚合酶 Gld2 (PAPD4) 结合。在卵母细胞中，含有 CPE 的 mRNA 具有短的 poly(A) 尾，导致翻译抑制，因为在这些细胞中，PARN 的活性高于 PAPD4 的活性（Kim 和 Richter 2006）。卵母细胞受精后，CPEB 被磷酸化，从而导致复合物中的 PARN 被排除在外。随后是 poly(A) 尾延长，导致翻译起始 ( Mendez et al. 2000）。总之，在早期发育过程中，蛋白质合成的时间调节通过 3' UTR 发生，并由 RBP CPEB 及其相关效应蛋白介导。因此，为了阐明不同的作用机制，需要鉴定和研究 RBP 的相关效应蛋白。

六、 超过一半的人类基因产生替代（ALTERNATIVE）的 3' UTR

RNA 聚合酶 II 对 DNA 的转录产生初级转录物，需要对其进行加工以产生成熟的 mRNA。mRNA 加工的步骤包括添加 5' 帽、剪接内含子和在 3' 末端切割/多聚腺苷酸化（Tian 和 Manley 2017 年综述）。转录不会在 mRNA 的 3' 末端停止，因为初级转录物超出了多聚腺苷酸化信号的数千个核苷酸（Core et al. 2008）。切割和多聚腺苷酸化机制的一些因素与 RNA 聚合酶 II 一起移动，遇到功能性多聚腺苷酸化信号会导致核酸内切酶切割，然后添加 poly(A) 尾 ( Chan et al. 2014; Schonemann 等人。2014 年）。因此，3'-末端切割和多腺苷酸化决定了 3' UTR 长度以及3' UTR 内存在 的顺式元件。

在发现 3' UTR 调节基因表达的多个方面大约 10 年后，一项文献调查显示，许多基因会产生在其 3' 末端不同的替代 mRNA 同种型。当时，已知 95 个基因产生替代的 3’UTR，而已知 31 个基因使用内含子多聚腺苷酸化位点来改变蛋白质的羧基末端以及 3’UTR ( Edwalds-Gilbert et al. 1997）。大约在同一时间，允许对互补 DNA (cDNA) 文库进行鸟枪法测序的新技术促成了表达序列标签 (EST) 数据库的创建。对这些数据库的挖掘表明，相当大一部分人和小鼠转录组使用替代的多聚腺苷酸化信号来生成具有替代 3' UTR 的 mRNA（Gautheret 等人 1998）。深度测序技术的发展使得建立能够在全范围内绘制 mRNA 转录组所有 3' 末端的方法成为可能（Derti 等人 2012；Hoque 等人 2013；Lianoglou 等人 2013；Gruber 等人 2016）。这些 3' 端测序方法表明，超过一半的人和小鼠基因会产生替代的 mRNA 异构体，它们的 3' UTR 不同，但编码具有相同氨基酸序列的蛋白质。

七、替代 3' UTR 异构体比率是细胞类型特异性的，并且会改变信号通路的激活

3'-末端测序方法提供有关 3' UTR 长度的信息并定量测量替代 3' UTR 同种型水平。对来自不同组织的样本进行 3' 端测序表明，功能性多聚腺苷酸化位点的位置不会因细胞类型而异，但替代 3’UTR 同种型的表达比率具有高度的组织和细胞类型特异性（Lianoglou 等，2013）。3'-末端测序数据可在数据库中获取，并可访问和浏览（3'-seq，参见 cbio.mskcc.org/leslielab/ApA/atlas ；polyA_DB，参见 exon.njms.rutgers.edu/polya_db/v3/ ; polyAsite, 见 polyasite.unibas.ch ) ( Lianoglou et al. 2013 ;格鲁伯等人。2016 年；王等人。2017 年；辛格等人。2018 年）。

与大量样本的 RNA-seq 数据相比，3' 端测序数据的可用性仍然有限。因此，如果可以从 RNA-seq 数据中提取替代 3' UTR 的表达，那将是非常有帮助的。尽管这已经被几个研究小组尝试过（Masamha et al. 2014 ; Chang et al. 2015 ; Shenker et al. 2015 ; Grassi et al. 2016），需要谨慎使用获得的数据，因为 3' UTR 上的 RNA-seq 读取覆盖率是高度可变的。如果使用严格的标准来识别 3' UTR 异构体表达的差异，则 RNA-seq 只会发现通过 3' 端测序方法识别的少量变化（10%–15%）。另一方面，不太严格的分析包含许多伪影，这表明从不同方法推断出的 3'-末端位置几乎没有重叠。此外，变化方向（3’UTR 的缩短或延长）仅在 15% 的被每种方法认为重要的事件中达成一致。因此，目前，3’端测序是确定替代3’UTR表达的首选方法。

除了细胞类型特异性之外，替代的 3’UTR 同种型表达对受体刺激和随后的信号通路激活有反应，如免疫细胞刺激或突触激活期间所示。3’UTR 异构体比率的变化可以通过将细胞暴露于细胞外刺激来实现，并且可以通过添加生长因子、细胞因子或神经递质进行实验模拟（Flavell 等人 2008；Sandberg 等人 2008；Rhinn 等人） 2012 年；格鲁伯等人 2014 年；贾等人 2017 年）。在正常发育和分化过程中，替代 3' UTR 的表达比率也会发生变化（拉克福德等人。2014 年；布鲁博等人。2018 年；弗雷默等人。2018 年）以及疾病（Mayr 和 Bartel 2009 年；Rhinn 等人 2012 年；Batra 等人 2014 年；Masamha 等人 2014 年）。最近发现，在小鼠卵母细胞从生泡阶段到中期 II 的成熟过程中，3' UTR 长度发生了显着变化，这需要 9 小时，导致 3' UTR 显着延长（Freimer 等人，2018 年）。对于约 20% 的基因，由于 miRNA 和 RBP 的结合位点的可用性发生了改变，替代 3’UTR 同种型表达变化的功能结果是蛋白质水平的差异。古普塔等人。2014 年；南等人。2014 年；布鲁博等人。2018 年）。

八、 3' UTR 调节蛋白质-蛋白质相互作用

替代的 3' UTR 很普遍，并且 3' UTR 序列在高等生物的进化过程中有所扩展（Mayr 2017）。因此，我们想知道 3' UTR 是否能够调节超出蛋白质丰度的细胞过程。在这种情况下，我们发现一些 PPI 仅在交互伙伴之一被 3’UTR 招募时才建立（图 1 B）（Berkovits 和 Mayr 2015）。这首先显示在 SET 和 CD47 之间的 PPI，然后扩展到人类细胞和酵母中的其他质膜蛋白（Berkovits 和 Mayr 2015；Chartron 等人 2016；Ma 和 Mayr 2018）。

CD47 膜蛋白由包含短或长 3' UTR（SU 或 LU）的替代 mRNA 同种型产生（Lianoglou 等人，2013 年）。编码的蛋白质具有相同的氨基酸序列，分别称为 CD47-SU 和 CD47-LU（Berkovits 和 Mayr 2015）。发现只有 CD47-LU 能够以 3' UTR 依赖性方式与蛋白质 SET 相互作用。因此，CD47-SU 和 CD47-LU 存在于不同的蛋白质复合物中，因此可以具有不同的功能。SET 与 CD47-LU 蛋白的结合导致更有效的质膜定位，更好地保护细胞免受巨噬细胞的吞噬作用，激活 RAC1，促进板状伪足的形成，并提高暴露于 γ 辐射后的细胞存活率（Berkovits 和 Mayr 2015）。这个功能列表可能并不详尽，因为 RAC1 激活具有多种下游后果，包括信号通路的激活和细胞迁移增加。

3’UTRs 能够调节蛋白质复合物的形成和确定蛋白质功能的事实表明，3’UTRs 中编码的遗传信息可以传递给蛋白质。这种信息传递可以调节氨基酸序列中未编码的蛋白质特征。由于 3' UTR 中包含的序列空间在高等生物的进化过程中不断扩大，因此 3' UTR 可能通过提供有关蛋白质的其他信息（包括有关 PPI、翻译后修饰、蛋白质构象和蛋白质多功能性的信息）来促进更高的生物复杂性。图。1公元前）。因此，关于蛋白质特征的信息可以遗传编码在未翻译的 mRNA 序列中。尚未显示 3' UTR 可以调节蛋白质构象，但这很可能发生，因为 3' UTR 依赖性相互作用伴侣与新生肽链的氨基末端的结合可能会改变新生蛋白质的折叠。

在发现这种新的 3’UTR 功能后，尚不清楚该功能的广泛性。似乎 3' UTR 介导的 PPI 很常见，因为它们也发生在细胞溶质和核蛋白上（Halbach 等人 2009；Duncan 和 Mata 2011；Lee 和 Mayr 2017）。IQGAP1 和 E3 泛素连接酶 BIRC3（也称为 cIAP2）之间的 3' UTR 介导的相互作用详细显示了这一点（Lee 和 Mayr 2017）。BIRC3 蛋白由替代的 3' UTR 生成。同样，由长 3’UTR 同种型产生的 BIRC3 蛋白称为 BIRC3-LU，而由短 3’UTR 同种型编码的 BIRC3 蛋白称为 BIRC3-SU。长BIRC33' UTR 促进了由 BIRC3-LU、激酶支架 IQGAP1 和 Ras-GTPase RALA 组成的蛋白质复合物的组装。重要的是，这种信号复合体不能由 BIRC3-SU 形成。3' UTR 依赖性信号复合物与 G 蛋白偶联受体 CXCR4 相关，并通过在配体结合后调节受体再循环来影响 CXCR4 的质膜表达（Lee 和 Mayr 2017）。信号复合物对 CXCR4 的 3' UTR 依赖性募集也具有生物学后果，因为它被证明是 CXCR4 介导的 B 细胞迁移所必需的。重要的是，尽管总体BIRC3相似在正常和恶性 B 细胞中观察到 mRNA 水平，BIRC3-LU 在恶性 B 细胞中相对于 BIRC3-SU 上调。预计这种上调会促进白血病细胞在体内的存活，因为 CXCR4 依赖性 B 细胞迁移被证明允许白血病细胞归巢于提供存活和增殖信号的骨髓壁龛（Lee and Mayr 2017）。

最后，涉及 E3 泛素连接酶 BIRC3-LU 的 3' UTR 介导的蛋白质复合物形成具有额外的分子后果，因为它控制酶的底物特异性。RALA 的翻译后修饰仅由 BIRC3-LU 而不是由 BIRC3-SU 完成，因为底物修饰需要事先的蛋白质相互作用（Lee and Mayr 2017）

九、 效应蛋白从 3' UTR 到蛋白质的转移机制

关于超出氨基酸序列的蛋白质特征的遗传信息如何从 mRNA 传递到蛋白质仍不清楚。但是最近确定了在 CD47-LU 和 SET 蛋白之间建立 3' UTR 介导的相互作用的要求（Ma 和 Mayr 2018）。发现此过程需要两个与富含 AU 的元素 HuR 和 TIS11B 结合的 RBP。HuR 的功能是招募 SET，而 TIS11B 创造了一个允许的环境，使 SET 与 CD47 和其他膜蛋白的 3' UTR 介导的结合成为可能（Berkovits 和 Mayr 2015；Ma 和 Mayr 2018）。TIS11B 形成 RNA 颗粒，丰富含有富含 AU 元素的膜蛋白编码 mRNA。TIS11B 颗粒形成与内质网交织的网状网。TIS11B 颗粒和内质网之间的功能相互作用创造了一个亚细胞区室，其生物物理和生化环境不同于细胞质。只有在这个特殊的隔间内才会形成无法在外部建立的特定 PPI。该隔间使 SET 与 CD47-LU 以及其他膜蛋白的 3' UTR 介导的相互作用成为可能（Ma 和 Mayr 2018）。此外，这些发现表明，富含 AU 的元素除了控制蛋白质丰度外还具有其他作用，因为它们调节功能相关的 3’UTR 介导的 PPI 的形成。

十、 3' UTR顺式- 元素通常重复并经常协同作用

3' UTR顺式元件有几个共同特征。一般来说，一个基序只需要 3-8 nt 就可以结合一个 RBP ( Lambert et al. 2014 )。这样的短基序通常在给定的 mRNA 中出现多次，并且可以以协同甚至合作的方式发挥作用（Kruys 等人 1989 ; Chao 等人 2010 ; Hennig 等人 2014 ; Hennig 和 Sattler 2015）。单个 3' UTR顺式元件的特征在之前的评论中进行了详细说明（参见Johnstone 和 Lasko 2001；Jambhekar 和 Derisi 2007）。

然而，mRNA 定位信号往往更长（50-500 nt），通常包含茎环，并且没有可识别或重复的基序（Johnstone 和 Lasko 2001；Jambhekar 和 Derisi 2007）。该规则的一个例外是β-肌动蛋白3' UTR中的邮政编码元素，最初被认为是 54 nt 长并且被 RBP IGF2BP1 识别，也称为 ZBP1 ( Kislauskis et al. 1994 )。然而，该基序被缩小为一个二分元素，该元素需要一个定义长度的间隔子，每个元素都被 IGF2BP1 的 KH3 或 KH4 结构域识别（Chao et al. 2010）。将序列缩小到一个基序很重要，因为它能够在全基因组范围内筛选包含额外基序的 3' UTR ( Patel et al. 2012 )。

顺式元件的鉴定很重要，因为它是鉴定结合和介导特定 3' UTR 功能的 RBP 所必需的。传统上， 使用缺失构建体确定顺式元件（ Macdonald 和 Struhl 1988；Kim-Ha 等人 1993；Kislauskis 等人 1994；Kim-Ha 等人 1995）。然而，通常，整个 3’UTR 的表型效应不能用 3’UTR 的孤立部分来概括。这在oskar mRNA的翻译调控元件和Hmga2 3' UTR 中的抑制元件中得到证实（Mayr 等人，2007；贝塞等人。2009 年；Kristjansdottir 等人。2015 年）。为了识别 2800 nt 长的Hmga2 3' UTR 中的元素，该元素能够完全概括对蛋白质生产的抑制作用，测试了一大组 3' UTR 片段，但没有一个片段具有完全的活性。最后，发现三个 3’UTR 亚区的协同作用对于完全抑制功能是必要的（Kristjansdottir et al. 2015）。

另一个例子是 4200 nt 长的CD47 3' UTR，其中负责 SET 结合的顺式元件分布在整个 3' UTR 中，并且没有一个测试片段包含完整的活性（ Ma 和 Mayr 2018）。为了找到完全概括所需表型的顺式元件，而不是使用缺失突变体，筛选了 50-200-nt 长、多样化和不相关的 3’UTR 元件。这一新策略确定了来自 TNF-α 的保守的富含 AU 的元素完全能够概括全长CD47的作用3' UTR 与 SET 结合有关。有趣的是，无论是 19 个 AUUUA 基序分布在整个CD47 3' UTR 上，还是当 6 个富含 AU 的元素连接起来（如 TNF-α 的富含 AU 的元素）时，都实现了相当的 SET 结合。这类似于构建转录因子结合位点阵列来研究转录因子功能。短cis元素的鉴定随后能够使用 RNA 寡核苷酸下拉和质谱法发现相互作用的 RBP（Ma 和 Mayr 2018）。

除了富含 AU 的元素外，许多其他顺式调节基序也是已知的 ( Ray et al. 2013 ; Dominguez et al. 2018 )，包括与 IGF2BP1、Pumilio、PTB 和 MBNL 结合的那些。然而，富含 AU 的元素是最早发现的顺式元素，并且仍然是研究最广泛的元素。

十一、 原代细胞显示出比细胞系更广泛的 3' UTR 异构体表达调控

3' UTR 异构体的比率很大程度上受信号通路的影响。因此，当将原代细胞或组织与细胞系进行比较时，原代细胞在 3’UTR 同种型表达中表现出显着更大的变化也就不足为奇了。除了变化的数量外，原代细胞的变化幅度更大（图 2）（Lianoglou et al. 2013）。内含子也可以发生选择性切割和多聚腺苷酸化（Edwalds-Gilbert 等人 1997），并且内含子多聚腺苷酸化信号的识别在原代细胞中比在细胞系中发生的频率要高得多（Lee 等人，出版中；Singh 等人。 2018）。因此，原代细胞有利于分析替代切割和多聚腺苷酸化。

图 2。 原代细胞在 3' 非翻译区 (3' UTR) 同种型表达中显示出更多数量和更大程度的细胞类型特异性变化。3'-seq 数据来自Lianoglou 等人。(2013)并用于计算七个组织和七个细胞系中替代多聚腺苷酸化位点使用的最大差异。使用是映射到 3' UTR 的所有读取中映射到单个多腺苷酸化位点的读取的分数。显示的是 50% 的基因具有最可变的 3' UTR 同种型表达。分析中仅包括产生两个 3' UTR 同种型的基因。

由于 3' UTR 同种型表达的细胞类型特异性，在分析之前将细胞分选成纯群体提供了比分析复杂组织更好的细胞类型特异性 3' UTR 表达模式的量化（Lianoglou 等人，2013 年）。如果不能选择分选，最近开发了 cTag-PAPERCLIP 来测量完整组织中特定细胞类型的 3' UTR 同种型表达。基于与绿色荧光蛋白 (GFP) 标记的多聚 (A) 结合蛋白 (PABP) 相关的 mRNA 3' 末端的 co-IP，该方法需要以组织特异性方式表达标记的 PABP 的小鼠 ( Hwang 等人。 2017 年）。

细胞系和原代细胞之间的代谢差异不仅会导致 3' UTR 异构体谱的差异，还会改变 miRNA 和富含 AU 的元素的调节作用（Kontoyiannis 等人 1999；La Rocca 等人 2015）。对于抑制目标 mRNA 表达的 miRNA，需要将它们加载到一个兆道尔顿大小的复合体中，称为 RISC（RNA 诱导的沉默复合体）。在细胞系和增殖细胞中，大多数 miRNA 存在于这些大型复合物中。然而，在原代细胞中，大多数 miRNA 与 RISC 的一个组成部分 Argonaute 结合，但不是更大的 RISC 复合体的一部分 ( La Rocca et al. 2015）。较大的 RISC 复合物的组装由信号转导通路的激活介导，包括 PI3K 通路。因此，在原代细胞中，miRNA 仅在通路激活后才能抑制其靶标（La Rocca 等人，2015 年）。这一原则可能适用于 RBP 的功能，因为信号通路可能影响蛋白质复合物的形成。

十二、 3' UTR 介导的体内调节

3' UTRs 对整个生物体中基因表达的强大影响已在小鼠模型中得到了最好的证明。第一个例子是c-fos转基因小鼠 ( Ruther et al. 1987 )。当包含其内源性 3' UTR 和多聚腺苷酸化信号的 c-fos cDNA 从强启动子表达时，未检测到 mRNA 表达。然而，在用逆转录病毒长末端重复替换 3' UTR 后，在整个组织中观察到高 mRNA 表达（Ruther 等人 1987）。因此，c-fos 3' UTR 是体内抑制 c-fos 蛋白产生所必需的。

在许多其他小鼠模型中，由于基因从其内源性启动子表达，因此采用了这一原则，但它们的 3' UTR 和多腺苷酸化信号被强多腺苷酸化信号取代。尽管可以在这些小鼠中评估 3' UTR 对表型的影响，但研究人员需要意识到，由此产生的表型是由 3' UTR顺式元件的缺失和通过更有效的 mRNA 加工过度表达的蛋白质引起的。编码 Camk2a 蛋白激酶的基因产生一个短而长的 3' UTR 异构体 ( Lianoglou et al. 2013）。用一个强多聚腺苷酸化信号替代两种亚型可防止 Camk2a mRNA 定位到海马神经元的树突。这会损害长期记忆的形成，因为树突状 mRNA 的定位和局部蛋白质的产生对于记忆巩固是必要的 ( Miller et al. 2002 )。神经营养因子 Bdnf 也由具有短或长 3' UTR 异构体的 mRNA 编码。Bdnf 在海马神经元中表达，长 3' UTR 异构体的完全破坏导致记忆形成受损（An et al. 2008）。Bdnf 也在下丘脑神经元中表达，并且这些细胞中长 3' UTR 同种型的破坏导致严重肥胖，并且在神经元中表现出完全的 Bdnf 敲除 ( Liao et al. 2012 )。

在小鼠中研究了其他生长因子、神经营养因子和酶的 3' UTR 功能，包括TGFβ1、Gdnf和醛固酮合酶（Kakoki 等人 2004；Andressoo 等人 2006；Kakoki 等人 2013）。观察到的表型范围从器官异常、血压升高到胚胎致死率。这些实验表明，使用不同的 3' UTR 可以将特定蛋白质水平改变 100 倍，这使得小鼠的 mRNA 表达水平从正常的 10% 到 900% 不等。如果完全基因敲除是胚胎致死的，这将特别有用（Kakoki et al. 2013）。

十三、研究 3’UTR 函数的 13 种新方法

13.1 CRISPR 技术促进了研究细胞系和生物体中 3' UTR 异构体特异性功能的新方法

从小鼠的 3’UTR 研究中，我们了解到保持内源性启动子和多聚腺苷酸化信号的调节应该是实验的重点。此外，迄今为止，3' UTR 亚型特异性功能主要使用标记的 3' UTR 亚型特异性过表达构建体进行研究（Sandberg 等人 2008；Mayr 和 Bartel 2009；Rhinn 等人 2012；Berkovits 和 Mayr 2015） , CRISPR（成簇的定期间隔短回文重复序列）技术的最新进展允许在内源基因座的细胞系和动物模型中更复杂地操作 3' UTR 同种型（Jinek 等人，2012 年；刁等人。2017 年）。

在以下段落和图 3中，显示了使用 CRISPR 技术研究 3' UTR 功能的实验方法。如果一个基因产生替代的 3’UTR，并且只有长 3’UTR 亚型的功能是感兴趣的，则图 3中显示的策略A 很有用。在实验装置中，比较了以下细胞系或小鼠：（1）野生型，（2）CRISPR介导的通过在编码区添加移码来破坏蛋白质，（3）稳定表达一种短发夹 RNA (shRNA)，靶向长 3' UTR 异构体，以及 (4) 对照 shRNA 的稳定表达。这种方法用于研究 CD47-LU 和 BIRC3-LU 的功能，如果长 3' UTR 异构体以低水平表达，则最合适，因为它的敲低不会太大改变整体蛋白质水平（Berkovits 和 Mayr 2015；Lee和 2017 年迈尔）。

图 3。 在内源基因座处使用 CRISPR（成簇的规则间隔短回文重复序列）技术来研究体内 3' 非翻译区 (3' UTR) 功能的实验方法。（A) 与总蛋白质敲除 (KO) 相比，该方法允许获得 LU 产生的蛋白质的唯一损失的表型。LU 异构体的丢失是通过短发夹 RNA (shRNA) 介导的敲低 (KD) 完成的。在 DNA 水平，箭头描绘了转录起始位点。pA，聚腺苷酸化位点；FS，移码突变。在 3' UTR 面板中，信使 RNA (mRNA) 同种型的最后一个外显子显示为浅绿色的短 3’UTR，深绿色显示的长 3’UTR。生成的蛋白质以蓝色显示。SU，由短 3' UTR 异构体产生的蛋白质；LU，由长 3' UTR 异构体产生的蛋白质。（乙) 允许从总蛋白质 KO 获得的表型与从短 (SU) 或长 3' UTR (LU) 同种型产生的蛋白质的专有表达进行比较的方法。如图A所示。红色三角形代表配对的指导 RNA 以删除 3' UTR 片段。（C）允许比较从总蛋白 KO 获得的表型与产生具有组成型 3’UTR 的 mRNA 的基因的 3’UTR 中的调节元件的排他性损失所产生的表型的方法。如图B所示。通过内源性多腺苷酸化信号对 mRNA 丰度的调节得以保留。

然而，如果长 3' UTR 同种型以显着水平表达并且需要保留整体蛋白质表达水平，则需要修改策略，如图 3所示B、可以使用。将 (1) 野生型和 (2) 蛋白质敲除产生的表型与仅表达 (3) 短或 (4) 长 3' UTR 同种型的细胞系或动物进行比较。为了获得仅表达短 3' UTR 异构体的细胞，使用一对指导 RNA 删除近端和远端多聚腺苷酸化信号之间的序列。这将远端多腺苷酸化信号移动到靠近近端多腺苷酸化信号的位置，并且在 mRNA 加工保持完整时应保持整体蛋白质表达。为了获得仅表达长 3' UTR 同种型的细胞，可以删除近端多聚腺苷酸化位点（使用一对指导 RNA）或被点突变破坏（李等人。2017 年）。由于 3' UTR 缺失也会影响位于基因 3' 末端的 DNA 调节元件（Sanjana 等人，2016 年），因此在实验中包含包含编码区和短或长的标记 cDNA 构建体是有用的3' UTR 异构体。这些构建体的表达将能够挽救观察到的表型，并确保表型确实是由 3' UTR 引起的，而不是由 DNA 调节元件的缺失引起的（Lee 和 Mayr 2017）。

为了研究具有单个 3’UTR 同种型的基因的 3’UTR 的调节作用，可以将野生型和蛋白质敲除与 CRISPR 介导的 3’UTR 缺失的细胞系或动物进行比较（图 1）。 3C )。在这种情况下，一对指导 RNA 用于删除终止密码子和多聚腺苷酸化信号之间的 3' UTR 序列。然而，应保留位于多腺苷酸化信号上游的约 100 个核苷酸序列，以便能够从内源性多腺苷酸化信号进行适当的 mRNA 加工（Zhao et al. 2017）。

除了 DNA 操作，通过反义吗啉代转染改变 mRNA 加工也可以转换 3' UTR 异构体的表达。迄今为止，该策略已被用于改变替代外显子的包含或排除，包括末端外显子的剪接（Vorlova et al. 2011）。然而，类似地，可以掩盖替代多聚腺苷酸化位点以改变替代 3' UTR 异构体比率（Marsollier 等人，2016 年）。

13.2 3' UTR 异构体-特异性翻译 （Isoform–Specific）

最近开发了几种新方法来研究翻译，但没有一种方法允许以 3' UTR 亚型特异性方式评估翻译（在Chekulaeva 和 Landthaler 2016；King 和 Gerber 2016中评论）。虽然现在可以通过同时成像 mRNA 和新制造的蛋白质来监测单个内源性 mRNA 的翻译，但这样做需要通过添加 MS2 或 PP7 外壳蛋白的结合位点来破坏 3’UTR（Chekulaeva 和兰德塔勒 2016 年）。

https://cshperspectives.cshlp.org/content/11/10/a034728.full

目前唯一可以以 3' UTR 异构体特异性方式检查翻译的方法是使用核糖标签或 TRAP（翻译核糖体亲和纯化）（Doyle 等人 2008；Heiman 等人 2014；Kocabas 等人 2015）。Ribo-tag/TRAP 通过在小鼠中使用 bac 转基因或 Cre-lox 系统，以细胞类型特异性的方式向大核糖体亚基的核糖体蛋白添加标签（Doyle 等人 2008；Heiman 等人 2014；Hupe et al. 2014），但可以应用于蠕虫、苍蝇、植物和酵母（King and Gerber 2016）。除了以细胞类型特异性的方式量化转录组外，核糖体相关 mRNA 的下拉还提供了翻译组的近似值，而无需纯化细胞。如果除了 RNA-seq 之外，还进行了 3'-末端测序，则 Ribo-tag/TRAP 能够以 3' UTR 特异性方式识别核糖体相关转录物。

13.3 替代 3' UTR 异构体翻译的时间调控

核糖标记技术在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的应用表明，替代 3' UTR 同种型的翻译受到时间调节（Yang et al. 2017）。这在Cyclin B1中详细显示，它表达三个 3' UTR 同种型。将核糖体相关 mRNA 的 RNA-seq 与荧光素酶报告基因分析相结合，发现短的 3' UTR 同种型在减数分裂的所有阶段都被组成性翻译。相比之下，较长的 3' UTR 同种型（包含 CPEB1 的结合位点）在休眠卵母细胞中以 CPEB1 依赖性方式被翻译抑制。然而，在通过减数分裂和进入细胞周期的过程中，这些较长的同工型变得多腺苷酸化，从而增加了核糖体的负载，并导致卵母细胞成熟期间细胞周期蛋白 B1 蛋白的表达增加（Yang et al. 2017）。

通过研究黑腹果蝇中 R 细胞向突触前末端的分化，揭示了非生殖细胞中替代 3' UTR 同种型翻译的时间调控的另一个很好的例子（Zhang et al. 2016）。这是一个特别好的模型系统，用于研究分化过程中的基因表达变化，因为 R 细胞在 72 小时内以同步方式从生长锥到突触前末端分化。在此期间进行转录组和 TRAP 分析显示 mRNA 丰度仅发生适度变化，但大量替代 3' UTR 异构体以时间方式改变了它们的核糖体结合。张等人。2016 年）。此外，编码突触前蛋白的 mRNA 改变其 3’UTR 同种型表达的频率是随机选择基因的两倍。因此，替代 3' UTR 异构体表达的变化以及替代转录物的动态核糖体关联是调节突触分化的主要因素（Zhang 等人，2016 年）。

在突触激活期间，在分化的神经元中观察到替代 3' UTR 同种型翻译的类似时间调节（Lau et al. 2010 ; Rhinn et al. 2012）。在静息神经元中， Bdnf和 α-突触核蛋白 ( Snca )的短 3’UTR 同种型被翻译以维持蛋白质表达的基础水平，而长 3’UTR 同种型被翻译抑制。相反，在激活后，无论是通过神经元活动还是暴露于多巴胺，只有长的 3' UTR 异构体与多核糖体相关并被积极翻译。因此，Bdnf或Snca的替代 3' UTR在静息和激活的神经元中翻译不同（Lau et al. 2010 ; Rhinn et al. 2012）。

13.4 相互合作的 RNA 结合蛋白的鉴定

最后，3' UTR 的功能由结合的 RBP 及其相关的效应蛋白决定。交联免疫沉淀 (CLIP) 可识别由单个 RBP 结合的所有 mRNA，而互补方法可检测所有结合单个 3' UTR 的 RBP ( Chu et al. 2015 ; Matia-Gonzalez et al. 2017 )。

然而，功能相关的 RBP 结合位点的识别是复杂的，因为基序通常是退化的。因此，在体内，RBP 的强特异性结合通常通过 RBP 的寡聚化来实现，这使得能够同时与多个位点结合 ( Besse et al. 2009 )。通过与另一个 RBP 的合作，也可以实现更强的结合和更高的特异性（Hennig 和 Sattler 2015；Mayr 2017）。然而，仅在少数特定案例中完成了合作对 RBP 的识别（Leeper 等人 2010；Campbell 等人 2012；Hennig 等人 2014；亨尼格和萨特勒 2015 年；李和迈尔 2017 年；马和迈尔 2018 年）。

为了系统地解决这个问题，最近开发了一个基于 CLIP 的实验程序 ( Gregersen et al. 2014 )。首先，RBP MOV10 的结合位点由 PAR-CLIP 确定。接下来，用 RNase 对交联细胞进行温和处理，以产生约 400 nt 的 RNA 片段。为了鉴定 MOV10 结合的 RNA 片段上的蛋白质，重复 MOV10 IP 并通过质谱法鉴定富集的蛋白质（Gregersen 等人，2014 年）。该方法发现 UPF1 是 RBP，主要是在 MOV10 结合片段上高度富集，并表明两个 RBP 的协同作用。

13.5 RNA结合蛋白效应蛋白的鉴定

在许多情况下已经表明 RBP 可以与多种效应蛋白相互作用。这表明 RBP 具有相当多的多功能性，超出了 RNA 代谢的调节。在某些情况下，RBP 的相互作用伙伴同时结合，如 CPEB 所示（Kim 和 Richter 2006）。在其他情况下，发现 RBP 是不同蛋白质亚复合体的一部分，每个亚复合体完成不同的功能。使用 3' UTR 介导的蛋白质复合物的 co-IP 或通过天然复合物的亲和纯化鉴定了不同的亚复合物（Hildebrandt 等人 2017；Lee 和 Mayr 2017）。

研究得最好的例子之一是 HuR，它可以调节 mRNA 稳定性、选择性剪接和选择性多聚腺苷酸化（Fan 和 Steitz 1998；Oktaba 等人 2015）。除了调节基于 mRNA 的过程外，HuR 对 3' UTR 介导的 PPI 也是必需的，因此参与调节几种膜蛋白的表面表达（Berkovits 和 Mayr 2015；Lee 和 Mayr 2017；Ma 和 Mayr 2018）。最后，UPF1 是众所周知的无意义介导衰变的调节因子，被发现也可以调节 MYOD1 的蛋白质衰变，MYOD1 是肌肉分化的主要调节因子（Feng et al. 2017）。

这些例子表明，研究 3' UTR 的不同功能需要确定 RBP 的效应蛋白。一项研究确定了 12 个 RBP 的 RNA 依赖性和 RNA 非依赖性蛋白质相互作用伙伴，包括 hnRNP、RBFOX2 和 UPF1 ( Brannan et al. 2016 )。通过与已知 RBP 的交叉，发现大多数交互伙伴 (72%) 是 RBP 以外的蛋白质。然而，由于这不是研究的重点，目前尚不清楚有多少已确定的因素是真正的互动伙伴。

RBP 具有丰富的相互作用组 ( Baltz et al. 2012 )。这可能是由于无序区域的富集，已知这些区域会促进 PPI。为了降低 RBP 的假阳性蛋白质相互作用伙伴的发生率，使用以下策略来识别包含 RNA 结合域的 E3 泛素连接酶的蛋白质相互作用伙伴 ( Hildebrandt et al. 2017）。在基于细胞培养 (SILAC) 的质谱法中用氨基酸进行稳定同位素标记比较了 co-IP 后 GFP 和 GFP 标记的 RBP 的相互作用组。重要的是，这两个实验条件已经在细胞裂解和 co-IP 之前合并，而不是在细胞裂解之后，这通常是这种情况。因此，瞬态相互作用物达到由轻标记和重标记形式组成的平衡，这应该导致 SILAC 比率接近背景比率（Hildebrandt 等人，2017 年）。此外，进行重复实验可以识别强大的交互伙伴（Brannan et al. 2016 ; Hildebrandt et al. 2017）。对于特定的 RNA 结合泛素连接酶，鉴定了 9 到 42 个稳定的蛋白质相互作用伙伴。大多数 (69%) 以不依赖 RNA 的方式结合，属于不同的功能类别 ( Hildebrandt et al. 2017 )，这表明 RBP 在基于 mRNA 的调节之外还有其他调节作用。

十四、 未来方向

1. 由于 3' UTR 可以调节蛋白质特征，因此测试 3' UTR 功能的读数需要超出蛋白质丰度的调节范围。

2. 由于 3' UTR 可以通过调节蛋白质复合物的形成来完成广泛的功能，因此需要确定 RBP 的蛋白质相互作用伙伴。大约一半已鉴定的 PPI 似乎在 RNA 生物学中没有发挥作用（Hildebrandt 等人，2017 年）。因此，研究 3' UTR 功能的机会超出了蛋白质丰度的调节。

3. 评估 3' UTR 功能的最大瓶颈之一是难以可靠地识别负责任的 顺式元件，特别是如果调节元件分布在整个 3' UTR 中。在 3' UTR 结构将分散的顺式元件聚集在一起的情况下，整个 3' UTR 具有高分辨率平铺的 CRISPR 缺失筛选可能有助于识别这些元件，因为结构的破坏可能足以检测表型。这种筛选最初是为了评估功能性蛋白质结构域而开发的，但最近也被用于发现增强子或功能性 miRNA 结合位点 ( Shi et al. 2015 ;桑贾纳等人。2016 年；吴等人。2017 年）。

4. 由于大多数 RBP 以低亲和力与位于 3' UTR 中的大多数简并基序结合，因此需要开发允许识别 RBP 对的结合位点的方法。共同绑定站点的识别对于网络分析很重要，并且可能有助于解开已知由 RBP 完成的相反功能。

参考资料

• What Are 3′ UTRs Doing? https://cshperspectives.cshlp.org/content/11/10/a034728.full