【3.3.2】毛细管电泳CE(Capillary electrophoresis)
自1981年引入分离科学以来，毛细管电泳（Capillary electrophoresis）技术已成为药物分析中的一项重要技术。CE技术的灵活性和多样化的检测模式，已经证明了其在生物分子（如氨基酸、肽、蛋白质、脂质、核酸、病毒等）分析上的巨大潜质。毛细管电泳（CE）具有分辨率高、操作自动化、样品量小等优点，近年来已成为生物样品分析中最先进的分析方法之一，也已经应用于了制药企业的药物申报和质控。
CE是一类以毛细管为分离通道，以高压电场为驱动力，依据样品组分之间电泳淌度和分配行为的差异而实现分离的新型液相分离技术。CE技术主要包括：
- 毛细管区带电泳（CZE） 根据电荷/质量之比的差异分离
- 毛细管凝胶电泳（CGE） 根据分子量大小的差异分离
- 毛细管等电聚焦（CIEF） 根据等电点的差异分离
其中，CGE中的CE-SDS,正在逐渐代替传统的SDS-PAGE，提供更加准确、快速的分析。mRNA等核酸疫苗的研发也常用CGE来分析核酸的纯度和大小。CIEF已经被用于蛋白质的表征，例如反映单抗药物的电荷异质性。
与CGE、CIEF相比，CZE在具有大尺寸的颗粒结构物质的分析上具有独特的优势，已被证明适用于蛋白质、核酸疫苗载体、脂质纳米颗粒（LNP ）、病毒或病毒样颗粒（VLPs）的表征。
图 CZE原理图
与其他胶体粒子一样，病毒及VLPs在其外表面携带有带电基团，形成双电层。因此，不同粒子在不同的缓冲液中具有不同的表面电荷和zeta电位，从而产生不同的电迁移速率，可用于分离和表征完整的颗粒。据报道，CZE已被报道可分离和测定脊髓灰质炎病毒 、人鼻病毒（HRV） 和豇豆花叶病毒（CPMV） 的病毒和亚病毒颗粒。它还用于检测不同血清型的HRV 、流感病毒和口蹄疫病毒（FMDV）。与荧光染料结合并与LIF检测器耦合可进一步实现比紫外检测器更高的检测灵敏度和对不同粒子的选择性检测。
一、RNA测定的应用
1.1 CGE-LIF方法对mRNA的分析
mRNA在制备、加工、配方和长期储存过程中可能会发生降解，因此通过对mRNA的纯度及完整性分析，对于产品质量保证和优化制造工艺至关重要。毛细管凝胶电泳匹配LIF检测器（CGE-LIF）可有效的依据mRNA片段大小来进行高分辨率的分离和高灵敏度的检测，表征mRNA的产品纯度和完整性。方法适用的mRNA范围较广，可进行0.2 kb-10.0 kb范围内的分析。如图1显示长度为4.5 kb 的mRNA的纯度和完整性分析电泳图。相似的，CGE-LIF方法还可以提供mRNA加帽效率、尾巴分布的分析。
CGE-LIF方法对mRNA分析的优势为：
- 自动化程度高：无需人工制胶、染色等繁琐步骤；
- 分辨率高：高电场的使用，提供比传统凝胶电泳更高的分辨率；
- 定量准确：利用峰面积进行准确定量，而传统凝胶电泳依靠条带亮度只能进行半定量；
图1. CGE-LIF进行mRNA分析的电泳图。RNA marker（蓝），4.5 kb的 mRNA（红，10 ng/uL）
1.2 CZE方法对载体（LNP等）的等电点分析
mRNA疫苗中，为了保证疫苗的递送，常使用脂质纳米颗粒（LNP ）等作为载体。为评估不同的生产工艺或批与批之间载体的一致性，可根据其等电点范围进行质量控制。传统的IEF 方法无法对完整颗粒的等电点进行测定，毛细管等电聚焦法（cIEF）是测定完整颗粒等电点的首选技术。
cIEF方法对病毒及LNP分析的优势为：
- 提供最准确的pI结果（3个pI marker测定）；
- 对分子量大小没有限制，可以测定蛋白，以及病毒、纳米颗粒等电点；
- 极高的分辨率，可达到0.03 pI；
参考资料
