【8.3.4.1】构建环形RNA稳定高效表达蛋白

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Daniel G. Anderson教授和他创立的Orna Therapeutics公司，今天我们将重点介绍，2018年大G发表在Nature Communication上的文章：Engineering circular RNA for potent and stable translation in eukaryotic cells.

此前提升线性mRNA的稳定性测策略包括使用UTR（ beta globin mRNA 5’UTR），帽子类似物( methylguanosine cap analogs)，修饰核苷酸(nucleoside modification )，密码子优化（codon optimization），这些方法对mRNA稳定性有适度的改善，但是还需要探索其他更好的方法。通过前面的介绍，我们知道circRNA不仅在细胞内非常稳定，而且具有编码蛋白的功能，所以大G就把目光锁定到circRNA，尝试探索下一代mRNA技术——在真核细胞中构建环形RNA来表达外源蛋白。

利用circRNA在真核细胞中翻译表达蛋白，总体来说，需要解决3个关键的难题：

  1. 如何实现RNA序列高效环化？
  2. 如何拿到高纯度circRNA？
  3. 如何实现circRNA高效表达蛋白？

一、添加同源臂完成long RNA的环化

体外RNA环化策略主要3种：

  1. 化学方法
  2. 连接酶方法（RNA or DNA ligases）
  3. 核酶方法（self-splicing introns）。

大G选择了一种具有自我剪接功能的T4噬菌体胸苷酸合成酶基因I型内含子序列（a permuted group I catalytic intron）来实现体外长RNA 环化，环化过程仅需要添加Mg+和GTP。

首先构建circRNA序列，3’Intron和5’Intron序列中间插入一段1.1kb序列，包括EMCV IRES（The internal ribosomal entry site，内部核糖体进入位点，是一种常见的RNA元件，用来启动 cap-independent translation），Gaussia luciferase 编码区，两个短的外显子序列（E1和E2）。通过体外转录反应合成出Precursor RNA，然后在镁离子和GTP存在下，发生两次酯交换反应（double transesterification reactions），形成circRNA。此方法之前就用于短RNA序列的成环反应，但是，大G发现用该方法无法成环，他推测可能是3’剪切位点和5’剪切位点之间相隔太远，降低了两个剪切位点接触的概率，从而降低成环效率，因为天然I型内含子两个剪切位点之间的距离只有300nt-500nt。

体外利用具有自我剪切功能的I型intron成环

所以，接下来，他在Precursor RNA 5’末端和3’末端分别添加了9个碱基互补配对的同源臂（weak homology arm）和19个碱基互补配对的同源臂（strong homology arm），结果添加同源臂以后，成环效率一下子就上去了，weak homology arm成环效率从0增加到16%，strong homology arm成环效率从0增加到48%，这里通过琼脂糖凝胶电泳来评价同源臂对成环效率的影响。

颜色表示碱基配对的可能性，红色表示配对可能性高。

为了证实成环反应的主要产物是circRNA，需要用到RNase R和RNase H两种酶，RNase R是一种外切核糖核酸酶，具有5’到3’降解活性，可以高效水解所有的linear RNA;RNase H是一种内切核糖核酸酶，当形成RNA-DNA杂交分子时，能够水解RNA的磷酸二酯键：

  • C：环化反应的产物，可以琼脂糖电泳可以看到circRNA，linear precursor RNA，nicked circRNA，三条带均出现。
  • C+R:环化反应的产物+RNase R，降解掉所有的linear precursor RNA,只有circRNA和nicked circRNA 条带。
  • C+R+H:环化反应的产物+RNase R+RNaseH,胶图中只存在nicked RNA条带，因为oligonucleotide-guided RNase H会将circRNA切开。
  • U:未经环化的IVT反应产物，只有precursor RNA条带。
  • U+H:未经环化的IVT反应产物,加入RNaseH以后，linear precursor RNA会被切割成两条带。

以上酶切反应，证实了环化反应确实生成了circRNA，但是存在nicked circRNA ，linear precursor RNA，splicing inter- mediates，excised introns副产物。

酶切反应验证环形反应的产物主要是circRNA

二、添加间隔序列（spacer）提升环化效率(circularization efficiency)

添加同源臂以后，环化效率只有48%，因此还需要找出进一步提升环化效率。由于IRES序列和3′ PIE splice site序列都高度结构化的，因此推测IRES序列可能会干扰剪切核酶的折叠能力，因此在3′ PIE splice site和IRES序列之间设计了一系列的间隔序列来阻止或者允许剪切环化，Permissive spacers 序列保留intron sequences内部的二级结构（对于核酶活性非常重要重要的序列），disruptive spacer破坏二级结构，特别是5’端intron sequences。结果发现，添加Permissive spacers可以把环化效率从46%提升到87%，而添加disruptive spacer会完全阻断剪切环化。通过添加同源臂和Permissive spacers能够环化长度在5kb 的RNA序列。

添加spacer序列提升环化效率

三、利用Anabaena PIE system 实现高效环化

使用以上相同的优化策略，大G从T4 catalytic intron 转向Anabaena catalytic intron ，并且在IRES序列和编码区3’末端添加了内部同源序列（internal homology），产生了一个独立的splicing bubble，环化效率上升到95%，并且与T4 catalytic intron相比较，nicked circRNA减少了37%。由于提升了剪切环化效率和circRNA产量，因此Anabaena catalytic intron在环化能力方面要强于T4 catalytic intron。

Anabaena PIE system

四、设计兼容不同CDS序列的Spacer

为了让circRNA construct可以有效环化各自不同的RNA序列，大G重新设计了Spacer,比较了不同长度的CDS序列环化效率，发现随着CDS-RNA序列增加，不仅环化效率和产量发生减少，环化产物中nicked circRNA 含量也会随着增加。Spacer设计需要优先考虑以下三点：

  1. 与IRES序列和邻近的Intron序列不存在同源序列，没有结构化的序列存在（不形成二级结构）。
  2. 可以将Intron序列和IRES序列分离开来，确保每一个元件可以独立折叠，独立发挥功能，不会彼此影响。
  3. 两个sapcer序列之间有一部分互补区域来促进splicing bubble的形成，splicing bubble含有具有催化功能的内含子序列。
circRNA序列组成

不同长度的CDS序列环化效率，Gaussia luciferase (total length: 1289nt)；human erythropoietin (1313nt)；eGFP (1451nt)；Firefly luciferase (2384nt)；Cas9 endonuclease (4934nt)

五、外源性circRNA在细胞内高效表达蛋白的优化策略

首先，研发人员把circRNA construct（RNase R-digested splicing reactions） 转染到真核细胞中，发现circRNA可以在细胞内表达出蛋白，但是由于RNase R 很难完全将precursor RNA消除掉，因此为了试验circRNA纯度对于蛋白表达的影响，研发人员构建了缺失splice site 的circRNA construct，也就是无法完成环化反应，全部是precursor RNA，转染细胞后，结果显示precursor RNA无法表达蛋白。

circRNA可以在细胞内表达出蛋白

precursor RNA无法表达蛋白

由IRES介导的Cap-independent translation蛋白反应表达效率依赖于细胞环境，不同的细胞，表达效率不相同，一般认为，IRES介导的Cap-independent translation蛋白表达效率不如Cap-dependent translation高。另外，polyA尾巴可以稳定和改善线性RNA表达效率。因此，研发人员试验了不同的IRES序列和添加PolyA尾巴对circRNA construct蛋白表达效率的影响，结果发现CVB3 IRES序列介导的蛋白表达效率在不同类型的细胞中都是最高的。在circRNA construct3' 末端添加ployAC或者ployA，也能够提升IRES序列介导的蛋白表达效率。

不同的IRES序列和添加PolyA/polyAC尾巴对circRNA construct蛋白表达效率的影响

六、使用HPLC纯化circRNA

circRNA纯度是另外一种提升蛋白表达效率的策略，并且避免引起机体的先天性免疫。少量的circRNA纯化可以用琼脂糖电泳凝胶，大量的circRNA纯化使用HPLC,两者方法在纯度上可以实现90% circRNA，10% nicked RNA。然后，再用RNase R消除 linear RNA。可以看到，使用HPLC纯化circRNA，对蛋白表达效率的提升优于用琼脂糖凝胶纯化或者只用RNase R处理。

HPLC纯化circRNA

七、circRNA蛋白表达效率与linear RNA比较

研究人员发现circ RNA表达蛋白表达效率和稳定性完胜未经修饰的linear RNA（具有帽子结构，核苷酸未经修饰）和化学修饰的linear RNA（尿嘧啶和胞嘧啶经过化学修饰）。

八、总结

总的来说，这篇文章通过序列优化，包括增加同源臂，间隔序列，筛选剪切能力强的I型内含子序列，初步解决长RNA序列的成环反应，并且有一个比较好的成环效率。另外一方面，通过纯化策略和筛选IRES序列以及添加polA尾巴，增强了circRNA在细胞内的蛋白表达稳定性和效率。但是，透过这些优化策略，我们可以看到circRNA在产业化方面存在严重的问题，成环效率会随着RNA长度增加降低，成环副产物复杂，没有解决大规模纯化问题，IRES序列介导的蛋白表达严重依赖细胞环境等等，再没有找到一个普适的环化载体序列以前，circRNA的产业化之路并不明朗。

参考资料

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